主题：【第六届原创】液相色谱柱的修复再生利用研究

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发表于：2011/09/24 19:38:40 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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随着我国的制药企业不断地发展，高效液相色谱法越来越多地用于药物的含量测定、有关物质的控制及稳定性考察等方面。色谱柱是其中很重要的一部分，十八烷基硅烷化键合柱（又称C₁₈柱）就占90％的比例。在长期的液相色谱分析工作中，发现色谱柱使用一段时间后，随着使用时间的推移、进样次数的增加，色谱柱往往会出现柱效降低，色谱峰峰高降低、峰宽加大、分离效果不佳、峰形不流畅的情况，也会有裂峰、肩峰、拖尾峰等情况出现，给日常的分析工作带来一定的困难，严重时直接可以使分析工作停顿下来。而且，挑选质地较好的液相色谱柱，价格约为3000～5000元不等，弃之不用报废实在可惜。为此，我们需要探索出解决此类问题的方法，满足检验要求，降低成本，达到为实验室降损增效的效果。

分析原因
一般情况下，C₁₈柱（或C₈柱，下同）在遇到极酸极碱的溶剂等情况下，会使填料的碳链发生断裂或倒伏情况，此种情况色谱柱不能再生。但最多的情况有以下几种情况：

1 色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；

2 色谱柱头的填料被样品或流动相污染，使样品进样后到色谱柱头上不能形成层析展开；

3 色谱柱的C₁₈的材质吸附中心表面受到污染掩盖，影响吸附脱附作用。

对策实施
我们对色谱峰峰高降低、峰宽加大或出现肩峰的色谱柱进行再生修复。具体步骤如下：

1 卸下色谱柱头，将筛板放在色谱甲醇中超声5min。

2 修补柱头。挖掉一点柱头被污染的部分，用C₁₈干粉的填料补充。

3 采用不同溶剂依次以15倍色谱柱的体积的甲醇、超纯水、异丙醇、乙腈冲洗。

确认效果
挑选实验室内有修复再生可能的部分色谱柱经再生修复后，重新使用于样品测定。通过比较再生前后HPLC图谱，确认色谱柱再生后的实际效果。

1、头孢哌酮钠含量测定色谱柱

样品：头孢哌酮钠

色谱柱来源：月旭材料科技（上海）有限公司

色谱柱材质：十八烷基硅烷键合硅胶柱（C₁₈），5µm，4.6×250mm
流动相：三乙胺醋酸溶液(三乙胺14ml与冰醋酸5.7ml，加水稀释至100ml，摇匀)-乙腈-水（1.2：180：820），并用冰醋酸调节pH值至3.0±0.2。

检测波长：254nm

进样量：20µl

流速：1.2ml/min

系统适用性溶液：含头孢头孢哌酮、头孢哌酮杂质A和头孢哌酮S异构体各0.2mg/ml的混合溶液。

色谱柱问题描述：
该柱使用两年半后，在头孢哌酮钠系统适用性图谱中，头孢哌酮峰分离不流畅，出现裂峰、肩峰，峰已成M形，见图01图02，此色谱柱已不能用于样品分析。
图01 再生前头孢哌酮系统适用性HPLC图谱（叉峰）

图02 再生前头孢哌酮系统适用性HPLC图谱（肩峰）

色谱柱再生后：

经再生修复后，裂峰肩峰消失，头孢哌酮峰形明显好转（本已废弃的柱子又恢复了生机）。按头孢哌酮杂质A、头孢哌酮和头孢哌酮S异构体的顺序出峰，各峰间的分离度3.43、2.56，均大于1.5，且头孢哌酮主峰理论塔板数达9291，符合测定要求，见图03：

图03 再生后头孢哌酮系统适用性HPLC图谱（峰型完美）

2、氯沙坦钾氢氯噻嗪片含量测定色谱柱

样品：氯沙坦钾氢氯噻嗪片
色谱柱来源：奥泰公司HP改良产品
色谱柱材质：辛烷基硅烷键合硅胶柱（C₈），5µm，4.6×250mm
流动相A：0.01mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾2.5g及磷酸氢二钠3.0g，加水溶解并稀释成2000ml，用三乙胺调节pH值至7.0）-乙腈（85：15）
流动相B：乙腈
检测波长：225nm
进样量：10µl
流速：1.0ml/min
对照品溶液：含氯沙坦钾和氢氯噻嗪分别为0.12mg/ml、0.1mg/ml的混合溶液。

梯度洗脱比例：

时间（min）	流动相A%	流动相B%
0	80	15
10	40	60
11	85	15
15	85	15

色谱柱问题描述：
该色谱柱使用一年半后，在氯沙坦钾氢氯噻嗪片对照品色谱图中，氢氯噻嗪峰峰高降低、峰宽加大，且有肩峰出现，见图04。

图04 再生前氯沙坦钾氢氯噻嗪系统适用性HPLC图谱

色谱柱再生后：
经再生修复后，肩峰消失，氯沙坦钾和氢氯噻嗪峰分离明显，分离度由之前的4.43提高到8.60；理论板数也提高很多，要求按氯沙坦钾峰计不低于2000，实际理论板数达到17773，见图05。

图05 再生后氯沙坦钾氢氯噻嗪系统适用性HPLC图谱

再看对照品色谱图，双对照进样5针，氯沙坦钾和氢氯噻嗪校正因子RSD分别为0.1％、0.5％，见图06～10。图11～12为样品图谱。
图06 再生后氯沙坦钾氢氯噻嗪对照溶液HPLC图谱（一）

图07 再生后氯沙坦钾氢氯噻嗪对照溶液HPLC图谱（二）

图08 再生后氯沙坦钾氢氯噻嗪对照溶液HPLC图谱（三）

图09 再生后氯沙坦钾氢氯噻嗪对照溶液HPLC图谱（四）

图10 再生后氯沙坦钾氢氯噻嗪对照溶液HPLC图谱（五）

下表列出了氯沙坦钾及氢氯噻嗪对照图谱数据：

序号	氯沙坦钾			氢氯噻嗪
序号	称量mg	峰面积	校正因子	称量mg	峰面积	校正因子
1	24.74	4404.51709	5.6170E-03	30.35	1923.80798	3.1489E-03
2	24.74	4403.29150	5.6185E-03	30.35	1908.63281	3.1739E-03
3	24.22	4322.09375	5.6038E-03	30.12	1918.61426	3.1335E-03
4	24.22	4319.61035	5.6070E-03	30.12	1909.71973	3.1481E-03
5	24.22	4317.09277	5.6103E-03	30.12	1917.88306	3.1347E-03
RSD	0.1％			0.5％

图11氯沙坦钾氢氯噻嗪片样品100311003批HPLC图谱（一）

图12氯沙坦钾氢氯噻嗪片样品100311003批HPLC图谱（二）

3、头孢哌酮钠舒巴坦钠含量测定色谱柱

样品：头孢哌酮钠舒巴坦钠
色谱柱来源：美国色谱科公司产品
色谱柱材质：十八烷基硅烷键合硅胶柱（C₁₈），5µm，4.6×250mm
流动相：0.005mol/L四丁基氢氧化铵溶液（取40％四丁基氢氧化铵溶液6.6ml，加水800ml后，用1mol/L磷酸溶液调pH值至4.0，再用水稀释至2000ml，摇匀）-乙腈（50：18）。

检测波长：220nm
进样量：10μl
流速：1.2ml/min
系统适用性溶液：
含头孢哌酮和舒巴坦为1mg/ml的混合溶液，其中相对保留时间约为0.9 的为头孢哌酮降解物峰。

色谱柱问题描述：
该柱用于头孢哌酮钠舒巴坦钠样品分析，使用一年多后，在系统适用性图谱中，头孢哌酮降解物峰、舒巴坦峰以及头孢哌酮峰响应值均下降，拖尾严重，见图13。

图13 再生前头孢哌酮钠舒巴坦钠系统适用性HPLC图谱