主题：【第六届原创】质谱在食品中有害有机物分析中的应用

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发表于：2011/10/20 19:08:38 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

质谱在食品中有害有机物分析中的应用

我国加入WTO后，农产品和食品市场进一步开放，无论是国产食品还是进口食品的安全性，都越来越受人们关注。食品安全不但影响消费者的身体健康，而且影响我国的进出口贸易。某些国家用食品安全问题设置贸易壁垒，作为农产品出口国，我国深受其害。为了保证食品安全，国家领导多次指出要加强检验手段、加强食品安全管理。食品中有害有机物分析的关键技术是科技部“十五”食品安全重大专项的研究内容。

除了物理及生物因素外，食品中残留的有害物质主要包括农药、兽药、有害化学物质以及微生物毒素等。现代农业的发展使种植业、养殖业中使用的农药、兽药品种越来越多，食品工业的发展带来了形形色色的添加剂。此外，在食品生产、运输、储藏、加工过程中也可能引入有毒、有害物质。这些都对农副产品、食品的安全检测提出了更高的要求。几十年来，各国分析工作者投入了大量精力，研究其分析方法。早期，人们主要使用化学法，光谱法；色谱仪的发展，使复杂样品中多组份分析成为可能。由于这些有害物质绝大多数为有机物，使得气相色谱和液相色谱成为食品安全检测的主要工具。但是，由于待分析有害物种类多达数百种，仅用色谱峰保留时间定性分析难以避免错误，1996年IUPAC规定指出“鉴定或确认方法必须尽量提供待测物的化学结构”，如果单一技术不能提供结构信息，或缺乏充分的“唯一性”，则需要由数种适合的技术, 包括样品净化、色谱分离、波谱鉴定，其中色质联用法为首选方法。用色谱分离待分析组分和干扰杂质，用质谱鉴定分子结抅, 可用全扫描、选择离子检测、多级质谱检测等各种方法。一般情况下，食品中的有害物质浓度很低；为了保证消费者的身体健康，它们在食品中的安全限量（最大允许残留量）一般为mg/kg(ppm)级至ug/kg(ppb)级；对人类有明显毒理作用的化学品，禁止在食品生产和加工中过程中应用，安全指标为检出仪器的下限，一般为0.1ug/kg。在这种情况下，质谱仪很难得到待测物的全谱。为了保证检验的准确性，在研究误差来源的基础上，总结了用质谱和色质联用仪确认有害物质的基本要求。为得到分子结构信息丰富的图谱以保证分析的准确性，要求最好用电子轰击电离方式；化学电离，大气压电离或其它低能量的电离方式所得到的图谱过于简单，难以滿足鉴定要求。在全扫描时，至少有4个离子大于基峰的10%，与标准图谱相比，主要离子丰度变化在80-120%之间。用选择离子可以提高检测灵敏度，但也增加了错误的几率。由于低质量范围内干扰离子多，残留分析中应尽量注意选择高质量数的离子。欧盟在残留分析要求中，明确表示需要用质量数大于100的3个离子或大于200的2个离子确认目标化合物。93年又明确指出需要3个鉴定点确认，当有害物残留超标时需要4点确认。低分辨质谱的每个离子为1个确认点，而高分辨的质谱的离子为2个确认点。进行多级质谱分析时，它们的母离子确认能力分別为1（低分辨质谱）和2（高分辨质谱）；子离子为1.5和2.5。许多药物和有害物质含氯或溴，由此产生的同位素簇、其独特的丰度比对待测物的鉴定有重要意义。在质谱裂解过程，它们常常脱去卤原子或卤化氢，与母离子相比，子离子质荷比的变化伴随着丰度有规律的变化，对鉴定待测物有特殊意义。如食品中有机氯农药残留、多氯联苯、二噁英、氯丙醇残留物等。在多年实验的基础上建立的试验规范，有助于规范食品安全检测方法，有利于食品安全管理和进出口贸易。

由于人们对食品卫生要求越来越高，要求被检测的化合物种类越来越多，多残留分析也就变的越来越重要。早期，色谱分离是多残留分析的难点，例如为完全分离86种农药，需用几种不同类型的毛细管柱。如，毒死蜱和对硫磷在30米长的DB-1和DB-5柱上很难分离，需用DB-17柱分离，而在DB-17柱上，对硫磷又和杀螟松色谱峰重叠。另外，由于待测组份多，彼此间的理化性质差别很大，给样品净化带来很大困难。其次，每种色谱仪的选择性检测器只能检测一类化合物，多残留分析不得不用多种检测器。近年来计算机技术的发展、仪器自动化程度的提高，质谱仪扫描速度的加快, 使多残留质谱分析方法发展迅速，有些成为政府管理部门的标准方法。用各个药物的质谱特征离子及质量色谱图，可以区分重叠峰中的不同化合物，使多残留分析中的分离工作不再是难点，如选用特征离子m/z 97，314，349（毒死蜱）；125，136，291（对硫磷）； 260，277（杀螟松）做质量色谱图即可将这一组难分离的化合物分开。用质谱的计算机编程，可根据不同化合物的色谱保留时间针对不同化合物选择各自的特征离子，这样可同时检测含不同元素、类型不同的化合物；避免用色谱多种选择性检测器的繁琐。更重要的是质谱选择性强，可排除样本基质的干扰。例如韮菜、葱、蒜等富含有机硫化物，在农药残留分析中对电子捕获检测器和火焰光度检测器都带来很强的干扰，我们用计算机编程，用差谱法选择特征离子，排除了干扰物质，区別了在色谱柱上重叠的组分：用气质联用仪的全扫描式及选择离子扫描方式同时检测了韮菜、大蒜中有机氯、有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯多种农药。由于GC-MS方法比气相色谱选择性检测器法更准确，在食品中农药残留分析方法的研究中，用来对方法的有效性进行确正。Lehotay S J报道了7个国家的17个试验室使用GC-MS考察了超临界流体萃取（SFE）对苹果、胡罗卜等食品中的多种农药残留分析的净化效果，认为使用选择性的SFE和GC-MS检测方法可以避免进一步的萃取净化步骤，但是对个别极性较弱的农药，例如菊酯类农药回收率偏低。

由于色质联用法的优越性，多残留分析的农药种类越来越多。1992年，报道了125种农药，1994年增加到199种。Julie Fillion等人用气质联用仪和液相色谱荧光检测器分析了199种农药在蔬菜和水果中的残留。其中用GC-MS分析了189种农药。样品（蔬菜和水果、）用乙晴提取，经活性碳净化后用GC-MS测定。因为待测组份过多，难以在色谱柱上一次分离，故将189种农药分为2组，分2次进样。根据样品中各组份出峰顺序，将第一组分为35个时间段、第2组分为20个时间段，用各组份的特征离子对样品进样检测。检测限为0.02-0.2ppm。2000年，进一步改进净化方法，该方法扩展到251种农药，其中用GC-MS分析了239种农药及其代谢物。为了控制分析质量，每种农药除了用2到4种特征离子结合保留时间定性外，还选用1到2组离子丰度比作为控制指标。为排除基质对定量的干扰，用不含农药的空白样品配置标样。这种多残留分析方法在很多国家的食品安全控制中都发挥着重要作用。我国十五攻关科技项目中也在研究多种食品中农药的多残留检测技术。

与农药相比，大多数兽药极性较强，很难直接用气质联用仪分析。为改变药物的色谱性状，早期的分析多采用衍生化法，大多数药物可直接烷基化或酯化后用气质联用仪分析。有些药物需要脱去极性基团后衍生化。如某些磺胺类药物的水解后硅烷化，喹诺酮类药物奥啉酸、萘啶酸、吡哌酸等酯化后虽然可用气相色谱分析，但灵敏度很低。Takatsuki用还原脱羧衍生法，使化合物的极性降低，色谱性状得到改善，用质谱选择离子检测，检测限低于10ug/kg。兽药分析的另一亇问题是样品基质干扰严重，产生的干扰离子大多在低质量区。与EI源相比，由于CI是软电离，质荷比大的离子较多，有助于排除干扰。而含卤原子的药物用负化学电离抗干扰能力更强，氯霉素用NCI检测，灵敏度可达0.1ug/kg。各种含氟的酰胺、酰氯、酸酐用来进行衍生化反应。如磺胺类药物用五氟丙酸酐衍生化，用负离子检测的下限小于1ug/kg。大多数兽药的气质分析法都较成熟。Daeseleire-EAI等使用GC-MS检测，通过气相色谱保留时间和质谱数据对牛肌肉组织或尿液中的睾丸激素, 雌二醇、孕酮等多种激素进行分析，最小检测限0.3µg/kg。

虽然衍生化法可以解决一些强极性化合物的分析，但许多化合物仍难以用气相色谱仪或气质联用仪分析。如某些氨基甲酸酯类杀虫剂、四环素类杀菌剂在高温下分解，红霉素等大环内酯类药物含多个糖基，或含氨基，衍生化过程复杂。磺酰类除草剂难于气化，不得不用液相色谱分析。有些药物用液相色谱分析也很困难。如大环内酯类药物，本身没有大的共轭体系，紫外吸收波长很短，紫外或二极管阵列检测器分析分析时一般用200-230nm左右波长，该波段为大多数有机化合物都有吸收，基质干扰严重，需要复杂的提取净化过程。高效液相色谱仪与质谱仪联用（LC-MS）适于这些有害残留物的分析鉴定。尤其对于需要高灵敏度，宽适用范围，复杂基质中的残留药物快速筛选工作而言，液-质应是最佳的检测手段。分析时需注意克服离子抑制现象，优化质谱分析条件，从而得到更有意义的质谱数据。Brian P等使用TSP（热喷雾）-LC-MS对牛肉组织中的有机磷农药以及它们的代谢物进行分析鉴定，在PI和NI 模式下，使用全扫描质谱检测，MS响应在1-100ppm范围内成线性，检测限1-5ppm，可以达到足够的灵敏度。液质联用仪可检测药物的分子离子和特征离子，选择性强，简化了样品净化过程，提高了灵敏度。Msagati-TAM等使用高效液相色谱（HPLC）分析牛的肾脏、肝脏组织以及牛奶等样品中的五种苯并咪唑类驱虫剂（噻苯咪唑, 丙氧苯唑,甲苯咪唑, 丙硫咪唑和硫苯咪唑）含量时，使用电喷雾电离质谱（ESI）代替液谱二极管阵列检测器（DAD）进行检测，检测灵敏度至少提高了两个数量级。在分析多杀霉素及其代谢物的残留时，如用DAD检测，净化时需严格调节pH值，分別在酸、碱条件下进行2次液液分配，而后进行柱层析。由于该药物在紫外检测器上响应值低，为保证检出低浓度样品，只好加大进样量至100ul。而用LC-MS分析，简化了净化过程，检测下限为1ug/kg。

当样品中干扰离子难以用常规方法排除时，可用多级质谱进一步排除干扰。如磺胺二甲基嘧啶的离子和常见的干扰物邻苯二甲酸二丁酯的分子离子质荷比相同，用分子离子作母离子进行MS/MS分析，从药物的子离子中选择特征离子进行药物的残留检测，排除了杂质的干扰。1997年Voimer用LC-MS/MS分析了15种喹诺酮类药物。使用MS-MS进行分析检测时，由于其消除基质干扰的能力较强，可以使样品的前处理变的更加简单。Steve Schachterle等利用GC-MS-MS对蔬菜水果中的多种农药残留进行了检测，样品处理简单，得到的结果不受样品中其它组分的干扰，检出限低，可达1－5ppb。Arrebola FJ等利用气相色谱-离子阱质谱（GC-MS-MS）技术分析蔬菜样品中的多种农药残留，对不同种类的化合物采用最合适的电离模式即EI-MS-MS或者是CI-MS-MS模式。在安装上玻璃衬套后，样品萃取后不经净化直接进样检测，农药的添加回收率范围在70－119%，相对标准偏差（RSD）小于16.9%，每种化合物的检测限范围在30-6µg/kg。Verzegnassi L等使用反相LC-MS-MS分析鉴定蜂蜜中10种不同的磺胺类药物，采用ESI-MS-MS阳离子模式检测，优化了分析条件。同时对每一种化合物选择两种特征离子进行监测，可以检测到蜂蜜中的µg/kg级水平残留，在50 µg /kg的添加水平下，回收率范围在44%-73%。解决了食品中痕量残留分析常常会遇到的基质诱导抑制离子化问题。

在提倡有机农业的今天，一些天然物被用来防治病虫害，如鱼藤酮、天然除虫菊酯和苦楝素等。这些天然物或由于分子量大，极性强，或由于热不稳定，无法用气相色谱分析。Xuejun Zhang等用液质联机（APCI/MS）分析了鱼藤酮等天然杀虫剂在甘兰、白菜和黄瓜中的残留。其中包括用作增效剂的胡椒基丁醚。样品用乙腈/水提取后，用C18固相萃取柱净化，胡椒基丁醚在上述作物中检出限分别为1、3、6ng/g，鱼藤酮为1、5、2ng/g，天然除虫菊酯的灵敏度较低，为25-200ng/g。这些天然物的分子结构影响了它们的灵敏度，虽然大气压化学电离是一种软电离方式，但是菊酯的酯键很容易断裂，生成的菊醇部分离子丰度高，菊酸部分不稳定，响应值很低。其它天然药物由于含有稳定的多环结构，质谱中的分子离子及高质量的碎片离子丰度较高，排除干扰能力强，信噪比较高。

除此之外，质谱在鉴定食品中的真菌毒素如黄曲霉素、玉米赤霉烯酮、腐马素、赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯酮等中，也发挥了重要作用。如黄曲霉毒素是1号致癌物，含多个组分，其中B1毒性最强，食品中的控制标准为2-10ng/g。Tuomi-T等人用LC-ESI-MS/MS同时分析了黄曲霉毒素的四亇组分B1、B2、G1、G2。样品经甲醇/水萃取后，用固相萃取柱净化，用仪器分析。MS/MS排除干扰能力强，避免了复杂的净化过程[16]。

在现代养殖业中，微量的激素就可提高生产效率，改变产品性状，对生产者有很大的吸引力。用的比较多的为同化激素，已有50多年的历史。如果消费者通过动物源食品长期摄入同化激素农药，会引起代谢紊乱，发育异常或肿瘤。同化激素的残留分析一直倍受关注。这些激素大多为含多环或大环的化合物。由于一些激素在食品中禁用（如甾类同化激素ASS），或最大允许残留量很低，因此要求用高灵敏度的分析方法。而同化激素种类繁多，许多激素结构相似，GC/MS在ASS类药物分析中起着重要作用。对样品硅烷化，或者酰化，而后用GC-MS/SIM分析。阳性样品可进一步用全扫描方式确认。二级质谱和高分辨质谱在这方面也发挥了重要的作用。如用EI-MS/MS分析玉米赤霉烯醇，检出下限达0.1-1ng/g。由于动物体本身就含有天然激素，或通过饲料摄入天然激素，加之动物源食品的复杂性，为分析带来困难。为区分天然内源激素和人工合成激素，Aguilera等根据不同来源激素的碳同位素丰度比不同，建立了质谱分析方法。动物体内的睾酮的前体是胆固醇，它的合成元素之一 — 碳来自于各种饲草，其13C/12C的丰度比应与各种饲草的平均丰度比一致；而人工合成的睾酮，其前体来源局限于某一种植物，如胆固醇大多来源于大豆，其碳同位素丰度比低。用同位素质谱仪与气相色谱仪联机，分析激素的丰度比，由此判断食品中是否含有人工激素。Guy-PA等使用LC-ESIMS-MS可检测肉类和肝脏中的l ng/kg克喘素（瘦肉精），在0.4mg/kg的添加水平下，被分析物的添加回收率为63%，质谱检测采用multiple reaction monitoring (MRM)模式，达到很高的灵敏度，最低检测限和定量限分别为10 ng/kg和15 ng/kg,选择m/z 277 和279作为母离子，在LC-ESI-MS-MS检测条件下，明确检测到待样品中克喘素结构中的两个氯原子的特征同位素离子峰。从而对其进行了准确的鉴定。

总之，近年来，质谱技术及其在食品中有害物质残留方面取得了很大发展。尤其是质谱联用技术和串联质谱技术越来越受到人们的重视，它能同时实现对目标分析物进行定性和定量分析检测，并可以对复杂基质的食品样品在分析时排除基质干扰，提高检测灵敏度，将会越来越多的被用于食品中有害残留物的分析检测中。

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