主题：【第六届原创】水产品中硝基呋喃类代谢物测定方法的简易改进

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发表于：2011/12/01 14:43:10 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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水产品中硝基呋喃类代谢物测定法的简易改进

洪波1、黄向荣2

1 湖南省水产科学研究所长沙 410153

2 农业部渔业产品质量监督检验测试中心（长沙）长沙 410153

呋喃类药物抗菌谱较广, 5-10ppm即能抑制多种革兰氏阳性和阴性菌,20-50 ppm有杀菌作用,对某些原虫、真菌亦有一定作用。日前，关于水产养殖中使用硝基呋喃药物的报道愈来愈多。此类药物进入食物链后对人体造成伤害，其人体不良反映主要是胃肠反应、溶血性贫血、血小板减少性紫癜、多发性神经炎(一般认为呋喃唑酮毒性较小, 如剂量超过0. 4 g/ d 或总量超过3.0 g 易引起神经炎) 、眼部损害、急性肝坏死和嗜酸性白细胞增多为特征的过敏反应。

通常用高效液相色谱结合紫外检测器和高效液相色谱配合质谱技术(LC/MS)测定硝基呋喃类代谢物在动物组织中的残留,笔者在HPLC定性定量的简便、快速、准确的方法基础上进行了方法的研究改进。

1 实验部分

1. 1 仪器与试剂

岛津LC–20A高效液相色谱仪，配紫外检测器；旋转蒸发器(上海亚荣化仪器厂)；高速冷冻离心机﹙德国HEMEL公司﹚；PHS一3C精密pH 计(上海雷磁仪器厂) ；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) ；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、异丙醇为色谱纯；庚烷磺酸钠、冰乙酸均为优级纯；盐酸、氢氧化钠为分析纯；C18–CN柱500mg/6ml﹙安捷伦公司﹚；呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮为Sigma 公司提供(纯度> 99 %) 。

1.2 色谱条件

Inertsil ODS- 3 色谱柱(5μm, 250 ×4. 6 mm) ；流动相: 甲醇＋乙酸乙酯＋异丙醇＋冰乙酸＋0.05%庚烷磺酸钠溶液﹙5＋5＋9＋0.1＋81﹚；恒流速1. 0 mL/ min ；柱温: 35℃；紫外检测波长280 nm；进样量50μL；外标法定量。

1.3 标准溶液的配制

准确称取一定量的标准品, 用少量甲醇溶解后, 再用甲醇定容为100 ug／mL 的储备液, 再以甲醇稀释成标准工作液。

1.4 实验方法

1.4.1 提取

准确称取已捣碎的样品10g,置于50离心管中，加入5g提取剂1及10ml提取剂2，超声漩涡混匀后35℃超声20min，6000r／min离心10min，取出上清液于另一支50ml离心管中，再加10ml提取剂2，重复提取一遍，合并提取液。

1.4.2 衍生化

在提取液中，加入衍生化试剂0.5ml混匀后，于45℃超声40min，取出冷却至室温。

1.4.3 萃取

用氢氧化钠调Ph值至7.0～7.5，加入10ml乙酸乙酯萃取，5000r／min离心5min后，取上层液体于鸡心瓶中，再加入10ml乙酸乙酯，重复提取一次，合并提取液于35℃减压蒸发至干，加入5%的甲醇溶液6ml,分两次溶解洗涤。

1.4.4 净化

先将净化柱一次用8ml甲醇、8ml水活化，待加入样液过柱后用10ml水淋洗，抽干，用10ml甲醇洗脱，转移至50ml鸡心瓶中40℃减压旋转蒸发至干，残渣用1.0ml 30%乙腈以及2ml异辛烷溶解，振荡混匀，6000r／min离心10min,取下层乙腈水溶液过0.22um微孔滤膜，供高效液相色谱使用。

2 结果与讨论

2. 1 色谱条件的优化

在HPLC 色谱条件下,分别对文献报道的几种流动相组成和pH值试验; InertsilODS-2／-3和Wondsil–C18 色谱柱; 275、280、380nm紫外检测波长等进行实验条件的优化,最后选择条件Inertsil ODS- 3 色谱柱(5μm, 250 ×4. 6 mm) ；流动相: 甲醇＋乙酸乙酯＋异丙醇＋冰乙酸＋0.05%庚烷磺酸钠溶液﹙5＋5＋9＋0.1＋81﹚；流速1. 0 mL/ min ；柱温: 35℃；紫外检测波长280nm；进样量50μL。优化色谱条件下的标准溶液、样品加标、的色谱图分别见图1。

2. 2 标准工作曲线

按照实验条件和方法, 在系列样品中进行系列浓度的加标回收, 经测定4 种硝基呋喃药物在1～100μg/ kg 的范围内有良好的线性关系, 相关系数分别为0. 9988 以上, 符合仪器分析方法的要求。

2. 3 方法的检出限

在本实验操作条件下,据3倍噪音的峰响应值、称样量和进样量, 计算出呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮的检出限分别为5、2、3、2μg/ kg。

2. 4 SPE 对回收率的影响及柱活化

分别选用Oasis HLB 、Sep-PakC18-CN萃取柱, 以及C18-CN柱填料量60/500/1000mg进行比较，发现 SPE 使杂峰的干扰较少, 操作简便、快速、灵敏，

2. 5 回收率与精密度

我们在鸡肉、鱼肉、虾肉系列样品中, 分别以10、20、50μg/ kg 的加标, 在本实验方法和条件下, 测定其3 种样品在3 个不同浓度水平的加标回收率、精密度。阳性样品、阴性样品的测试结果见表1。

组分

加标量

(ug/Kg)

回收量

(ug/Kg)

回收率

(%)

变异系数

(%)

AOZ

10.0

20.0