主题：【原创】每周一毒贴之---真菌毒素专题（1）黄曲霉毒素

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imtoxiner

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发表于：2011/12/08 15:19:16 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

写在最前面的话：注册这个名（imtoxiner）有近10个月了，一直觉得对不起这个名字，今天我终于鼓足了勇气来证明一下，我还是很毒的（但是不狠毒的毒哦），毒素的----毒（toxin）

每周一毒贴之真菌毒素专题-（1）黄曲霉毒素

1、黄曲霉毒素基本信息介绍：
黄曲霉毒素是由黄曲霉Aspergillus flavus和寄生曲霉Aspergillus parasiticus在一定的温度、湿度条件下产生的真菌毒素。黄曲霉毒素是世界卫生组织癌症研究机构划定的1类致癌物质（记住了，很毒的哦）。黄曲霉毒素是由一组大约18（B1，B2，G1，G2，M1，M2，P1，H1，Q等）种类似结构的相关的真菌代谢产物组成（很牛啊，有18种之多）。植物来源的食物及中草药通常只污染B1，B2，G1，G2；M1 和M2是从牛奶中分离出来的，而这两种黄曲霉被认为是来源于饲料。附图为黄曲霉毒素的照片（下，左图，看着就比较恐怖，是不是？）

农业食品方面：黄曲霉毒素主要污染花生、玉米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品，其次是小麦、高粱和甘薯，大豆粕等。

药用植物方面：主要污染陈皮、神曲、白芍、胖大海、酸枣仁、桃仁、等……动物药主要为僵蚕，最新的研究发现土鳖虫也容易污染黄曲霉毒素；2010版中国药典规定陈皮、僵蚕、胖大海、酸枣仁、桃仁五种药材需要检测黄曲霉毒素（有个ppt上总结的污染的情况比较好，借来一用，请见上右图）

2、结构及理化性质

黄曲霉毒素的的基本结构为二呋喃环和香豆素，几种主要的黄曲霉的结构式如下图（本人以前年轻的时候自己画的，不知道有没有什么地方有问题，大家帮看看哦，好像是少了一个M2）黄曲霉毒素难溶于水、己烷、乙醚和石油醚，易溶于甲醇、乙醇、氯仿和二甲基甲酰胺等有机溶剂。分子量为312 - 346 ，熔点为200 - 300℃，黄曲霉毒素耐高温，加热很难破坏其结构。

3、对人体的危害（不说了，反正是很毒）

4、检测方法

4.1、提取、净化与富集

提取：粉碎后甲醇-水提取，其他提取系统包括乙腈-水，氯仿-水系统，提取方式摇床震摇，高速匀质，超声提取都有用过，高速匀质比较快一点，有优势（这是我自己总结的哦）。

净化与富集：早期采用液液萃取发，后逐渐被固相萃取法取代，C18，硅胶，Florisil硅土以及有装有极性、非极性、离子交换等混合填料的商品化柱子如Mycosep226净化柱,M-160多功能净化柱等。

免疫亲和柱由于其特异性吸附的原理，有非常高的回收率及非常好的检测限，是近年来发展最快的一种黄曲霉毒素的净化技术，国内外众多的厂家都有商品化的免疫亲和柱上市(艾杰尔，有的)

典型的免疫亲和柱净化-高效液相检测的使用方法如下图所示（提取液的比例还得自己去试验或者参考标准，不一定非是70%甲醇哦）

（感谢原作者提供使用免疫亲和柱方法示意图）

4.2、检测方法：

检测方法很多，薄层色谱法，酶联免疫法，分光光度法，金标试纸，生物传感法以及液相色谱法等等。

大多数人可能只用过HPLC法，由于AF具有较强的紫外吸收和产生荧光的特性，因此可以进行HPLC-紫外或荧光检测，但是同时黄曲霉毒素中的B1,G1由于其荧光强度比较弱一并且在含水的流动相中容易产生荧光淬灭（这个具体的概念我也说不完整，反正就是灵敏度不行啦）。

因此在很多的实验中都会采用衍生法测定黄曲霉毒素，衍生的方法也很多：有柱前的，柱后的，在线的。

柱前衍生一般采用三氟醋酸(TFA)衍生，柱后衍生一般采用碘化（2010版药典就是碘衍生法）或者溴化，还有采用在线的光化学衍生的，在线衍生的装置在跟大家说一下（据说就是一个紫外灯在里面照射的哦，详情不是很了解，因为没用过）

借用一个本版版主的图片（感谢版主允许我引用此案例），黄曲霉标准品图（B₁、B₂、G₁、G₂），酸枣仁加样回收图谱及操作详情请参加下述链接。

链接：http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20100810/2710731/

黄曲霉毒素免疫亲和柱（艾杰尔），色谱柱：Venusil MP C18 (4.6*150mm, 5μm)

5、黄曲霉毒素相关标准

乱七八糟的找了一些，部分打包供下载（见下图，感谢标准提供者某某某）

国内：药典限量标准：B1含量≤ 5μg/kg ,总量≤ 10μg/kg

GBT 5009.23-2006 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定

牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的测定液相色谱-荧光检测法 GB/T 23212-2008

食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定GB 5009.24-2010

食用植物油卫生标准 GB 2716-2005

食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定 GB 5009.24-2010

据说国外是欧盟最严格B1含量≤ 2μg/kg ,总量(B1，B2，G1，G2)≤ 4μg/kg

6、展望：多种黄曲霉同时检测、新型方法如在线衍生，质谱同时定性定量检测是发展趋势，快速检测也是一个趋势，由于其毒性强烈，自动化固相萃取设备在黄曲霉毒素前处理中也会有较好的应用前景，此外，中药黄曲霉毒素也将越来越受到重视……

7、附------2010版药典黄曲霉毒素检验法（文字版）

附录Ⅸ V 黄曲霉毒素测定法

本法系用高效液相色谱法(附录ⅥD)侧定药材饮片剂制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒B₁、黄曲霉毒索B₂、黄曲霉毒素G₁和黄曲霉毒素G₂总量计），除另有规定外，按下列方法测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水(10：18：42)为流动相，流速每分钟0.8ml；采用柱后衍生法检测。衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加人甲醇100ml使溶解，用谁稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每挣钟0.3ml衍生化温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm(或365nm），发射波长λem=450nm。两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混和标准品（黄曲霉毒B₁、黄曲霉毒索B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂标示浓度分别为1.0ug/ml、0.3ug/ml、1.0ug/ml、0.3ug/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

供试品溶液的制备取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45um）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱（AflaT-est@P），流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀。即得。

测定法分别精密吸取上述混和对照品溶液5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，诸如液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，另精密吸取上述供试品溶液20-25ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒索B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂的量，计算，即得。

【附注】（1）本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。

（2）残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。

谢谢，每周一毒贴之真菌毒素专题-（1）黄曲霉毒素---------------------完，有不当之处敬请补充修正

鉴于近期的黄曲霉毒素事件，很多地方都在做M1的快检，简单跟大家讨论一下酶联免疫法的原理（个人见解）

酶联免疫法是采用免疫原理进行（黄曲霉毒素分析）的方法之一。

具体的方法是：讲酶标记在抗体/抗原之上，形成酶标抗原/抗体，在抗原与抗体形成复合物之后，酶会与加入的底物作用食指显色，根据颜色深浅，定性或者定量抗体或者抗原。

附件：

黄曲霉相关标准.rar