前言
代谢产物的鉴定在药物代谢研究过程中意义重大，如何准确地鉴定代谢产物的结构一直是广大药物代谢研究工作者致力攻克的难题。代谢产物的鉴定之所以难主要有以下几点原因：1.代谢产物在生物样品(血浆、尿液、胆汁、粪便等)中浓度极低。2.代谢产物容易受生物样品中内源性物质的干扰。3.代谢产物的不稳定性。4.仪器的灵敏度不够，等等。目前鉴定代谢产物的方式多为通过HPLC与质谱检测器进行联用推测代谢产物的结构，但该方法存在缺陷，如对同分异构体束手无策等。本实验前期通过专业的分离技术，得到某代谢产物M1，为重要的Ⅱ相代谢产物，该代谢产物因为量少(6mg)无法完全通过核磁鉴定，本文通过核磁给出的结构信息结合酶水解巧妙地鉴定了该代谢产物的结构，涉及保密，只给出有差别的部分结构信息。

1.试剂
色谱甲醇(Fisher)，去离子水(Eyela Still Ace, SA-2100 E1, 日本）,三氟乙酸(TFA,Dima)，β葡萄糖苷酶(Sigma)。
2.液相色谱条件
Shimadzu HPLC system, 由LC-10ATVP 泵, SPD-10AVP 紫外检测器, 以及CTO-10ASVP 柱温箱组成, 工作站为浙江大学N3000工作站。
色谱柱：Ultimate XB-C18柱(5μm, 4.6x250mm)
流动相：A通道：甲醇，B通道：水(0.05% TFA)
流速：A通道0.500mL/min；B通道0.500mL/min
柱温：30℃
检测波长：275nm
进样量：20μL
3.样品准备
对照品溶液的配置：取各纯品0.5mg，加入1mL50%甲醇水溶液，涡旋1mL，微孔滤膜过滤。水解过程：取代谢产物M1 0.5mg，溶于1mL水中，加入适量葡萄糖水解酶，37℃孵育2h，加入2mL的乙酸乙酯萃取，萃取2次，合并萃取液，45℃减压浓缩至干，用1mL50%甲醇水溶液溶解，进样分析。
4.结果与讨论

图1.代谢产物M1水解前的分析图谱(tR=8.951min)

图2.代谢产物M1水解后的分析图谱(tR=8.958min为剩余的未水解的M1，tR=14.720min为水解产物)

图3.已知化合物C1的分析图谱

图4.已知化合物C2的分析图谱

图5.水解产物与C1和C2合并进样分析图谱

1.代谢产物M1只有6mg，理论上核磁是可以鉴定的，但基于一些原因，核磁谱图结果不理想，只能通过别的方法鉴定。但是从图1来看，代谢产物M1的纯度是很高的，如果用面积归一化法来计算的话，其含量至少在95%以上，但作者在此给大家透露点信息，代谢产物不同于植物中的化学成分，即使在色谱图上显示单一的色谱峰，但绝对纯度不一定很高，往往有未知的内源性成分如影子一样伴随着它，作者推测这可能是核磁图谱测试不理想的原因之一。
2.机缘巧合的是，代谢产物M1两种水解产物均作为已知化合物被作者分离得到，并准确鉴定，因此剩余的实验就显得顺理成章。
3.化合物C1和C2在结构上很相似，仅仅是葡萄糖醛酸基的位置不同，因此其表现在色谱行为上的差别也很小，如图5所示，二者没有达到基线分离。
4.从各分析图谱可以看出，相同化合物的保留时间重现性非常高，且峰形之正太有目共睹，体现了Ultimate XB-C18柱的优越性能，保证了代谢产物结果鉴定的准确性。具体参数如：理论塔板数、分离度、对称因子等在此不一一列举。
5.在整个分析过程中系统压力为19.4MPa左右，波动不超过0.2，换算为PSI也仅为2800左右，在流动相比例为50%的情况下，如此低的压力给测试者营造了“轻松的”实验氛围，避免了系统压力高产生的漏液报警的烦恼。
6.一句话小结：本实验运用酶水解结合HPLC分析，成功鉴定了代谢产物M1的结构。