三、膜的选择
以上谈了该行业的一些发展现状，那么我们大致了解后，回到最关心的问题，如何选择膜? 经常会遇到的问题是，我是做**项目的，我该选择那类膜?
这里涉及到一个膜的分类标准问题，一个供应商可能提供这个膜是8um,但另一个供应商告诉你膜是135s的。这之间的区别与联系是什么?
um指的是膜孔径，而从上面膜的生产过程，我们可以看出，膜的孔径实际上是没有办法界定的。由于干燥成型等过程的非绝对均一，膜的孔径也是非均一的。膜孔径的说法实际上是沿用了一直以来的一个形象称呼。而以秒为单位的定义为，每4cm膜，水的层析时间是***s.该单位已经越来越被各大厂商所接受，成为了一个通用的比较标准。以下我们将采用s单位来进行交流。
换算情况大致为: 8um=135s; 6um=180s.
不同秒数的膜对反应有什么影响呢?
首先，我们分析一下液体在膜上的运动过程。 一张长度为4cm的膜， 每隔1cm做一个标记， 当液体运动过标记处时记录时间点。 那么你将会发现液体在膜上的运动是呈减速前行的。 而两张不同秒数的膜(例如135s, 180s)在同一时间标记点处的运动速度不同。这个试验用清水做不好观察，可以考虑用色素水溶液，非常明显。
那么从这个试验可以看出，在通过同一T线喷点位置时， 金溶液通过的速度是快速膜>慢速膜。 那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短， 读数快， 那么灵敏度也就越低。 反之， 反应时间长， 读数慢， 也就灵敏度高。 同时还有一个问题是， 反应时间越长， 发生非特异性结合的可能性就越大， 所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。 所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡。
其实我们并没有那么多选择。 经过使用实践， 各供应商一般都只提供两个型号， 就是135s和180s. 虽然看到有些厂家的产品目录上型号种类繁多，但这两个型号的定货量就占了95%以上， 其他型号供货上也就远不如这两个型号来得顺利。 135s一般用在双抗体夹心法， 180s一般用在竞争法。 你所要做的是，先选择其中的一个型号， 然后比较不同供应商同一个型号的差异， 由于前面说的添加配方与你的试验条件配合的不同，这个差异可能大也可能小。 具体要根据试验结果来确定最后的选择。
我个人不建议地毯式的测试不同规格/不同厂家的膜， 这样成本高， 成功的几率也小。
四、膜的质控方式
本节适合用膜量较大的公司用户参考。对于一卷膜可以用上几个月的用户来说， 厂家的质控标准已经完全能满足你的要求，而不需要自己再做相关的质控。
膜的质控虽属于原辅料QC职能， 但由于其专业性强， 一般都由小样调试人员来执行。 膜入原料库后需要进行如下检验工作:
1、 查收COA
在购买时， 供应商会随产品为每个lot的膜提供一张纸质的出厂质量证书， 该证书被称为COA. 如果你已经购买某一批次的膜， 而没有索取相应的证书， 如果有需要可提供批号向厂家要求补发。 其实在很多行业都有厂商为自己的产品附上COA的习惯。
COA一般只提供给大客户， 对小客户是没有意义的。
其内容主要是厂家在产品出厂时做过一些测试的罗列。 作用可以理解为质量凭证和测试数据参考。
2、 检查物理性能
膜的物理性能主要是2个参数， 膜厚度和宽度。 长度不需要检测。 使用中可以关注长度上是否有断面重接现象， 断面多费料则多， 少数发生。
厚度， 由螺旋测微尺，选择几个测量点检测后算平均。 膜生产的必测参数。 主要表现为厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能， 点出来的C/T线宽窄不一。 另外也影响爬速。
宽度， 普通直尺测量。
物理性能一般都不会有什么大问题。 毕竟检测标准客观， 易把握。 没有条件执行的厂家可省略。
3、 跑水性能
样本采用含有有色食用色素的水溶液， 目的是容易观测。 需制作一个简易支架。
操作: 注入足够溶液到下部槽内， 将不同批次膜每隔1cm做一次标记(总长大于4cm)并放到倾斜支架， 整个支架下端放入溶液槽， 膜开始吸液， 计时。 记录每个标记处的通过时刻， 并与对照组比较。
跑板时， 理论上溶液呈水平线形式上吸， 观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象。
4、 点样测试
C/T线出线时间， 其他试验条件相同情况下， 记录和比较C/T线出现时间是否与对照有差异。
灵敏度， 比较不同样本浓度情况下， T线的变化是否和对照组同。 一般每批次膜取前端一段用来测试即可。 由于制造过程的不均一性， 不同批号的灵敏度会有一定差异， 当大批量使用时， 这种差异影响是非常大的， 那么就要按照灵敏度表现将不同批号的膜进行分类。 在膜的STOCK中要能够轻易的分辨出来。 当进入后期生产调用时， 就能根据这些分类， 按照订单要求取用不同批号的膜， 或者用强灵敏度的原料和差灵敏度的膜来搭配。
关于膜的批内差。 批内差是肯定存在的，只是差距大小的问题，依据一般的测试条件是很困难获得详细的数值，因为你不可能对每一卷膜的每一段都做详细的测试。 减小膜批内差的最有效方法是不购入边缘膜带。 前面说过膜的生产方式，生产出的半成品是宽幅很大的一个膜面，要通过截面裁切才能获得25mm或者20mm的宽度。那么就有中间部分，和边缘部分之分。越靠近中间部分，膜的均匀性越好，边缘部分则相对要差，就造成了批内差。 一般可以通过COA获得具体位置信息，例如MILLIPORE就在切割后用字母A,B,C……来表示切出的窄膜在宽幅膜中的位置。
如果是试用某个型号的膜小样， 还需要在以上检测后加入膜加速老化试验。 包括膜单独的老化试验和点好膜后产品的老化试验， 具体试验方法请参看我以前写的研发思路一文。
五、膜的深入探讨和应用技巧
从本节开始，我们开始对膜进行深入讨论和谈一些应用技巧。
1、 蛋白与膜的结合原理
蛋白与膜的结合原理， 已知的结合力包括疏水作用力\H键\静电作用力等，确切的结合原理并不明确，主要靠假说来支撑。主要有两种假说:
（1） 首先两者靠静电作用力结合， 然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合。
（2） 首先两者靠疏水作用结合， 然后靠静电作用来维持长时间结合。
两条假说， 都表明其结合过程分为两步， 首先结合和后面长时间结合。由于结合原理的不明确性， 导致在这方面的工作非常依赖实践经验。
2、 膜对结合的影响
（1）膜孔径
有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜，但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品，如果是不同厂家的产品，这种比较是无意义的。 膜孔径与层析速度的关系，已在上文描述。
随着膜孔径减小，膜的实际可用表面积递增，膜结合蛋白的量也递增。 估量表面积的参数为表面积比率(实际可用表面积与所用膜平面积的比率)。
另外， 膜孔径越小，层析速度也越小，那么金标复合物通过T线的时间也就越长，反应也就越充分。
综合以上两点，结论为膜孔径越小灵敏度越高。但是同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，也就是假阳性越高。所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜，找到合适的平衡点。
（2）不同厂家的膜差异
这个差异主要来源于两点：
A、生产膜时，使用的聚合物和表面活性剂的来源，类型，数量不同。同理，在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响。
B、处理过程不同。
3、 生物原料，缓冲溶液的试剂和配方
（1）生物原料， 作为CT线的生物原料使用情况各异，所以这里只做略述。
首先，单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体， 主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点， 而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别， 毫无疑问就增加了优化难度。
其次，分子量越大，蛋白越难结合到固相材料上。
（2）缓冲液
大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方，包括缓冲液，封闭液等等处理溶液配方。
其实我也无法提供给你一个万用配方清单。 因为不同的反应体系需要不同的配方来支持， 而不同机构的反应体系又有差异。 想获”鱼”先学”渔”。 为了不误导大家，我在下面涉及到配方的问题上，仅提供思路，具体配方请自己摸索。
缓冲液的构成一般是: PBS(或其他缓冲体系)+作用物质(针对某一特定问题)+PH调整。 我在参考过以前的各种资料后，个人意见为配方原则为宜简不宜繁，根据自己的需要添加作用物质，原来的很多需要添加的作用物质，由于膜制造技术的改进已经不再需要。
推荐的缓冲体系为0.01M PBS PH7-7.2, 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性。
作用物质的情况大致罗列如下:
少量NACL,减少信号强度，消假阳。
有机醇(甲醇，异丙醇等)，润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被。个人不推荐，因制膜工艺改进。
表面活性剂(TW20,TX100)，增加亲水力，可避免线条中空现象，也可增色。
糖，保护剂，减缓老化速度，也可以增加亲水力同上。
调PH到某个位置，可以消假阳。
4、 点样环境
环境湿度对点膜过程非常重要。最佳湿度一般在45-65%。
湿度过低，膜上容易聚集静电荷，点膜容易出现散点，导致测试会出现疏水斑。
湿度过高，膜上毛细作用加强，点膜容易引起CT线变宽甚至扩散。
为了保证点样时膜湿度的均一性，一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。
5、 点样仪器与膜面情况的关系
目前有两种点样方式，划膜式和非接触点膜式。非接触点膜式优于划膜式，进口划膜式优于国产划膜式。
因划膜式为软管将抗体划到膜表面，而膜本身的物理性质为软脆，划管会在其表面留下印痕。进口的划膜机由于使用的材料和控制系统较好，所以留下的划痕较轻，而国产仪器较差，留下的划痕也就比较严重。 划痕容易对层析的金标复合物形成阻力，导致假阳性。 同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线(鬼线)，而跑板结束后鬼线消失的奇怪现象。
6、 膜的宽度与点样位置
膜的宽度一般有18mm(or 20mm)和25mm两种， 分别使用在做测试条和做测试板上。
然而，不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度。 点样位置上移，金标复合物通过T线位置时速度变慢，反应时间增加，灵敏度升高。 反之灵敏度降低。 这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性。
7、 溶液在膜上的扩散
溶液在膜上的点样量一般情况下为1ul/cm.
溶液在膜上的扩散是趋向两端的，喷点上去的是均匀的抗体溶液，但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间，中间的抗体会不断向两边扩散，所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的。一般情况下不影响你的试验。如果你发现线条出现两端红，中间淡的现象，就要考虑这个问题了。可以加如上面说的作用物质来解决。
8、 点膜前后的封闭作用
从供应商处购买回的膜基本上都是已经优化处理好的，直接点膜就可使用。然而我们还是经常会遇到关于封闭的讨论。
其实封闭不象大家认为的那样，一封闭什么问题都解决了。 老问题走了新问题又来了，而且更麻烦，我要说的是慎用封闭。
我极其反对点膜前封闭的做法。 原因为厂家在生产膜时候，各种配方是混合加入原浆的。而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内，必然扰乱了膜内正常的物质分布。由此引发了许多问题，也降低了工作效率。 也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题，其实可以通过其他办法来解决，封闭必然是下测。
我经常使用的封闭手法有两种。
流动封闭，将作用物质处理在样品垫上。
膜上定点封闭，将作用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上。 该方法需要使用BIODOT的AIRJET喷头。可以将不合格的半成品大板重新复活。
只要是将封闭做在了膜上，就必然会对产品的稳定性造成影响。具体的影响程度要通过稳定性测试来评判。
9、 膜的储存
刚生产出的膜一般含有5-10%的水分。 关于膜的老化机理，有个理论支持，不过争议比较大。 理论认为:膜的老化是因为膜上的水分蒸发，使膜变得疏水，带电荷并变脆。 储存膜一般要求是避光，密封。过干或过湿都不利。在这种保存条件下，一般可以放置两年。 但是如果膜上做了封闭处理，就要根据具体试验情况来判断了。
有些膜由于生产工艺的问题，使用后灵敏度会在一段时间内发生变化，遇到这种问题，就需要在点膜后放置一段时间，待稳定后方可进入调试生产。
后 序
以上便是我在胶体金层析诊断试验中使用硝酸纤维素膜过程中的一些经验。从起笔到结尾花了大约一个月时间，断断续续，终于完成。 也要感谢所有膜生产厂家技术专家在以前的工作接触中给我做过的大量技术培训，其中很多已经成为了经常联系的朋友。由于膜工业是在不断发展的，可能出现新的问题或新的解决办法。
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