主题：【转帖】做microRNA的，必须提取RNA检测基因表达水平的改变

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发表于：2012/03/03 10:03:12 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

我们实验室主要是做microRNA的，所以必须提取RNA检测基因表达水平的改变。
这里我就说说几点我自己的个人感受：

一、关于组织标本的收集：
听隔壁实验室说他们提取的RNA经常降解，他们认为主要原因就是标本的收集过程不够严格（由于客观原因，他们往往都是在标本离体一个多小时后才能收集到标本，对此他们也很无奈）。
我们实验室每周都会派一名研究生去手术室收集标本。我们的要求是在组织离体30分钟内就放入液氮中，然后回实验室-80°长期保存。由于标本量大，我们基本上都会选择近半个月收集的标本来提取RNA,所以貌似到目前为止还没有出现过RNA降解的情况。

二、关于RNA酶的失活：
网上看过很多别人的经验，大多数意见是：RNA酶是导致RNA降解的罪魁祸首。我个人认为到不必如此，因为一个酶要发挥作用需要特定的温度和一定的时间。现在用试剂盒提取RNA也就半小时左右，而且还是冰上操作，因此还没有等RNA酶来得及发挥作用就全部操作完成了。
但是对于预防RNA酶还是需要的。
最开始我们选择用DEPC水来浸泡枪头和EP管，这确实是吃力不讨好的工作：DEPC对人体有毒而且易挥发；DEPC比较难于溶于水需要加温搅拌过夜才能完全溶解；DEPC如果不去除干净（主要是通过高压灭菌失活）会影响提取的RNA的质量。所以后来我们基本上抛弃这种方法了。
现在我们采用的方法是：用XYGEN盒装的枪头（外面带包装好的塑料薄膜）和袋装的EP管，使用之前灭菌一遍即可。若暂时没有盒装的枪头，我们就用蛋白酶K溶液浸泡枪头和EP管15分钟，然后高压灭菌。个人觉得效果都很好。

三、关于RNA提取的操作：
组织的匀浆比较重要。貌似现在还是有不少实验室采用匀浆器研磨组织。我也试过，很累而且效果一般。
我们现在用的是MP的匀浆仪，自动匀浆45秒钟即可，若觉得一次匀浆不够充分可以在冰上放置2分钟后再次匀浆45秒，匀浆效果非常好，但是费用比较贵：一个带有陶珠的匀浆管大约需要45RMB（一个管只能匀浆一个标本而且是一次性的）。
后续的提取我们都是采用试剂盒的，方便且快捷。国产试剂盒50次的大约400多元。

四、关于RT-PCR：
其余不说，单独谈谈内参的选择。
我们主要是做荧光定量PCR，RT做的不多。
由于要通过内参来比较不同组织中某个基因的表达是否改变，所以我认为内参的选择相当关键。绝大多数文章都用GAPDH或者β-actin来做内参，但是不知道大家思考过没有：他们为什么这么选择，依据是什么，别人选择的内参是否也适合你自己的实验呢？
答案是否。
举一个我自己的例子。我是研究肾癌的，刚开始我选择用GAPDH作内参，得出的结果和且他文章上的不一致。当时我比较困惑：莫非别人都错了，就我是对的？（呵呵，自己都知道是不可能滴）
后来经过查阅文献发现有人明确指出GAPDH不适合在肾组织中用作内参（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17559644?dopt=Citation）。换了一个文献中推荐的内参后，实验结果终于和别人一致了。

其实随着实验经验的增长，RNA水平的操作相对于蛋白水平的操作（western-blot、免疫组化）要简单一些。我相信只要大家能多实践、多交流（尤其是上论坛看看别人的经验），做出漂亮的实验只是时间问题而已！

附一张我们实验室MP匀浆仪的图片，推荐如果经费充足可以采购试试。
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