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主题：【讨论】蛋白水解液中多肽的测定色谱峰异常？

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有水有渝
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发表于：2012/03/24 14:45:32 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
一，蛋白水解液前处理：

取适量约（1ml）蛋白水解液置5mL离心管，加水1ml稀释后加入15%三氯乙酸溶液1ml，乙腈5滴，振摇5min后静置10min（尽量使蛋白质沉淀完全）。离心15min，吸取上清液3d，用0.1%的磷酸溶液稀释至约2.5ml,摇匀。过0.22um滤膜。

二，色谱条件：

流动相：A泵  0.1%磷酸溶液；

                B泵  0.1%磷酸溶液－乙腈（80%∶20%）；
       
检测波长：λ1＝215nm  λ2＝280nm ；  色谱柱：C18柱 4.6*250mm

流速： 1.0ml/min ；

柱温： 30℃ ；

进样量：20ul ；





峰形如此，感觉是很多峰没有分离开，大家觉得分析方法哪里可以改进？
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2012/3/24 14:53:42 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
多肽分离是不是要用凝胶柱？
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yssb2012
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2012/3/24 14:56:59 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 有水有渝(xky0230699) 发表:
一，蛋白水解液前处理：

取适量约（1ml）蛋白水解液置5mL离心管，加水1ml稀释后加入15%三氯乙酸溶液1ml，乙腈5滴，振摇5min后静置10min（尽量使蛋白质沉淀完全）。离心15min，吸取上清液3d，用0.1%的磷酸溶液稀释至约2.5ml,摇匀。过0.22um滤膜。

二，色谱条件：

流动相：A泵  0.1%磷酸溶液；

                B泵  0.1%磷酸溶液－乙腈（80%∶20%）；
        梯度洗脱


检测波长：λ1＝215nm  λ2＝280nm ；

流速： 1.0ml/min ；

柱温： 30℃ ；

进样量：20ul ；



峰形如此，感觉是输送机很多峰没有分离开，大家觉得分析方法哪里可以改进？
  可不可以尝试一下改变溶液浓度
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2012/3/24 14:57:38 Last edit by yssb2012
有水有渝
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2012/3/24 15:43:20 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
已补充说明使用的是C18柱，已用TCA沉淀大部分的蛋白质。15-20min这一段完全没有要分离的迹象，如果再降低有机相比例，那分析时间太长。
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Alex0802
zhao3220g
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2012/3/25 20:48:37 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
柱子的柱效高吗？是5um的填料吗？其次，你进样浓度大概是多是，是否过载，此图有点像过载的样子！ 或试一下其他的酸吧（TFA，AcOH等），建议A和B中都加一定比例的乙腈！
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有水有渝
xky0230699
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2012/3/26 9:38:48 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 Alex0802(zhao3220g) 发表:
柱子的柱效高吗？是5um的填料吗？其次，你进样浓度大概是多是，是否过载，此图有点像过载的样子！ 或试一下其他的酸吧（TFA，AcOH等），建议A和B中都加一定比例的乙腈！


TFA还在购买中，由于检测波长选择为215nm，不适合使用AcOH，样品浓度无法估计，因为没有对照品，实际情况是这个多肽的组成成分完全不知道。
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sungw
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2012/3/26 14:17:49 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
蛋白水解液能分成啥样，看许多柱子公司自己发的BSA水解液，都是上百个峰，建议用TFA试试吧，还有就是C18的柱子选择300A孔径，对分离效果应该有好处！
梯度也可以适当调整下吧，前面峰密度大，缓一点，后面峰少就陡一点喽，呵呵，纯属纸上谈兵哈，几年前做过水解蛋白的纯化，痛苦的经历……
该帖子作者被版主 xky0230699加 2积分， 2经验，加分理由：感谢参与讨论
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有水有渝
xky0230699
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2012/3/27 12:44:30 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 tangtang(tangtang) 发表:
多肽分离是不是要用凝胶柱？


小分子量多肽可以用反相柱，大分子和蛋白质要用凝胶柱。

上次的分析图，分析方法相同，反应液反应时间较短
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sungw
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2012/3/27 13:46:39 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
梯度应该还能优化
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liufeilzu
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2012/3/29 20:26:21 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
优化梯度，一般水解多肽我们用离线二维色谱分离
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有水有渝
xky0230699
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2012/3/29 21:04:48 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
这个梯度也是从参考文献上得来的，等有空改进一下再来回复。
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