主题：【原创】提问帖（3.30）大家谈谈高速逆流色谱吧

高速逆流色谱(high speed countercurrentchromatography，简称HSCCC)是一种液-液色谱分离技术，它的固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附，具有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优点。由于HSCCC与传统的分离纯化方法相比具有明显的优点，因此此项技术己被广泛应用于中药成分分离、保健食品、生物化学、生物工程、天然产物化学、有机合成、环境分析等领域。我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家。张天佑等在国内首先自行研制了分析型和制备型的高速逆流色谱仪，对我国中药功能成分的分离制备取得了显著成果。上海同田生化技术有限公司生产的高速逆流色谱仪，分离中药成分纯度达到99%，可用于HPLC检测标准样。 　　高速逆流色谱 （ high-speed countercurrent chromatography ， HSCCC ）是 20 世纪 80 年代发展起来的一种连续高效的液—液分配色谱分离技术， 它不用任何固态的支撑物或载体。 它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。 　　由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。 　　它相对于传统的固—液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。目前 HSCCC 技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域， 特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技 术；适合于中小分子类物质的分离纯化。 　　我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。美国FDA食品和药物管理局(Food and Drug Administration)及世界卫生组织（ WHO ）都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定， 90 年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。

原理
　　1.　逆流色谱是20世纪50年代源于多极萃取技术（非连续性）  多极萃取技术(请点击查看大图)
　　但是多极萃取设备庞大复杂、易碎、溶剂体系容易乳化，溶剂耗量大，分离时间长。 　　2. 通过公转、自转（同步行星式运动）产生的二维力场，保留两相中的其中一相作为固定相  高速逆流色谱原理(请点击查看大图)
　　2.通过高速旋转提高两相溶剂的萃取频率，1000rpm旋转时可达到17次/s频率的萃取过程。 　　  高速逆流色谱原理2(请点击查看大图)
　　3.HSCCC分离流程图 　　  HSCCC分离流程图(请点击查看大图)

发展史
　　1．20世纪70年代，出现了液滴逆流色谱（DCCC） 　　特点： 　　（1）流体静力学原理（Hydrostatic equilibrium system，HSES） 　　（2）分离时间过长、连接处容易出现渗漏等 　　2．20世纪70年代出现了离心分配色谱仪（Centrifugal partition chromatography，CPC）  离心分配色谱(请点击查看大图)
　　特点： 　　（1）基于流体静力学原理（Hydrostatic equilibrium system，HSES），利用公转产生的单一力场 　　（2） 连接处较多而且容易出现渗漏，清洗维护复杂 　　3．20世纪80年开始出现了现在的高速逆流色谱，可称为最先进的逆流色谱 　　特点： 　　（1） 基于流体动力学原理（Hydrodynamic equilibrium system，HDES）  流体动力学原理(请点击查看大图)

应用领域
　　（ 1 ）天然产物已知有效成分的分离纯化 　　（ 2 ）化学合成物质的分离纯化 　　（ 3 ）中药一类、五类新药的开发 　　（ 4 ）中药指纹图谱和质量控制研究 　　（ 5 ）抗生素的分离纯化 　　（ 6 ）天然产物未知有效成分的分离纯化（新化合物开发） 　　（ 7 ）海洋生物活性成分的分离纯化 　　（ 8 ）放射性同位素分离 　　（ 9 ）多肽和蛋白质等生物大分子分离以及手性分离等
色谱仪构造
　　仪器的中心部分：(a) ITO多层线圈分离柱，它是由100-200米长、内径为1.6mm左右的聚四氟乙烯管沿具有适当内径的内轴共绕十多层而成，其管内总体积可达300mL左右。(b)平衡器，它可以调节重量，它的作用是让(a)， (b)相对于中心轴两边重量平衡。当在旋转控制器的控制下，在齿轮传动装置作用下，(a)，(b)同时绕中心轴作顺时针或反时针的行星运动，即(a)- (b)本身既在自转，但同时又在绕中心轴公转，公转转速可从0-4000r/min。从线圈分离柱中通过中空的中心轴还同时牵引出了线圈的两端，一端供泵入液用，一端输出液体。仪器工作需要互不相溶的两种液体，一相作固定相， 一相作移动相。仪器工作前，先将作为固定相一相的液体通过恒流泵压入线圈分离柱，然后用进样器将待分离的样品按如图所示进样，最后用恒流泵压入移动相，同时启动中心部分运转直到转速大于600r/min。此时，两相在线圈分离柱中具有相对运动之势。由于移动相源源不断的压入，阻止了固定相的流出，同时，移动相带着样品在线圈分离柱中进行无限次的分配而使复杂样品得到分离。当移动相经过检测器时，由于不同的样品组分会产生不同大小的信号，用记录仪就能得到逆流色谱图谱，同时用馏分收集器分步收集移动相就会得到复杂样品被分开的组分。较大的制备型HSCCC，柱容积可达530m1，一次最多进样可达20g粗品；较小的分析型的HSCCC柱容积为8m1，进样量为几十微克，最大转速可达4000r/min，分析能力堪与HPLC相媲美。
特点
应用范围广，适应性好
　　由于溶剂系统的组成及配比可以是无限多的，因而从理论上讲可以适用于任何极性范围内样品的分离，在分离天然化合物方面具有其独到之处。由于聚四氟乙烯管中的固定相为液体不需要固相载体，因而可以消除固-液色谱中由于使用固相载体而带来的吸附损失，特别适用于分离极性物质。
操作简便，容易掌握
　　仪器操作简单，对样品的预处理要求低，一般的粗提物即可进行的制备分离或分析。
回收率高
　　不需要固相载体，消除了由于样品在固相载体上的不可逆吸附和降解造成的损失，理论上样品的回收率可达。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。
重现性好
　　如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，即使多次进样，其分离过程都保持很稳定，而且重现性相当好。
分离效率高，分离量较大
　　由于其与一般的色谱分离方式不同，能实现梯度洗脱和反相洗脱，亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高，制备量大。
分配系数
　　溶剂系统的选择是同时选择色谱分离过程的两相，是对样品成功分离的关键所在，而样品中各组分的分配系数决定着这种溶剂系统是否合适，因此分配系数的测定是选择溶剂系统的重要环节。目前，分配系数的测定多采用薄层色谱法、毛细管电泳法、HPLC法、生物活性分配比率法及分析型HSCCC法。

高速逆流色谱原理
高速逆流色谱技术(HSCCC)是一种不用任何同态载体的液．液色谱技术，其原理是基于组分在旋转螺旋管内的相对移动而互不混溶的两相溶剂间分布不同而获得分离，其分离效率和速度可以与HPLC相媲美。HSCCC分离效率高，产品纯度高；不存在载体对样品的吸附和污染；制备量大和溶剂消耗少；操作简单，能从极复杂的混合物中分离出特定的组分。
HSCCC应用于天然产物的分离可实现：(1)制备高纯度的药用成分对照品和必需控制的杂质成分；(2)配合活性跟踪与入药部位的设计，逐级分离制备活性部位或活性成分；(3)中药材和中药方剂指纹的建立，提供更丰富的信息和数据；(4)进行中试批量生产和工业生产。如中科院工程研究所探索了利用HSCCC制订中药指纹图谱的方法，以丹参原药材为模式植物，初步建立了丹参的HSCCC指纹图谱。该技术有望成为中药有效成分质量标准研究的一种新方法及中药生产的一种新型分离技术。

高速逆流色谱技术(HSCCC)是一种不用任何同态载体的液．液色谱技术，其原理是基于组分在旋转螺旋管内的相对移动而互不混溶的两相溶剂间分布不同而获得分离，其分离效率和速度可以与HPLC相媲美。HSCCC分离效率高，产品纯度高；不存在载体对样品的吸附和污染；制备量大和溶剂消耗少；操作简单，能从极复杂的混合物中分离出特定的组分。
HSCCC应用于天然产物的分离可实现：(1)制备高纯度的药用成分对照品和必需控制的杂质成分；(2)配合活性跟踪与入药部位的设计，逐级分离制备活性部位或活性成分；(3)中药材和中药方剂指纹的建立，提供更丰富的信息和数据；(4)进行中试批量生产和工业生产。如中科院工程研究所探索了利用HSCCC制订中药指纹图谱的方法，以丹参原药材为模式植物，初步建立了丹参的HSCCC指纹图谱。该技术有望成为中药有效成分质量标准研究的一种新方法及中药生产的一种新型分离技术

溶剂体系和溶液系统
　　高速逆流色谱常用基本溶剂体系表 　　被分离物质种类  基本两相溶剂体系 辅助溶剂
非极性或弱极性物质 正庚（己）烷-甲醇 氯烷烃

正庚（己）烷-乙睛 氯烷烃

正庚己烷-甲醇（或乙睛）-水 氯烷烃
中等极性物质 氯仿-水 甲醇、正丙醇、异丙醇

乙酸乙酯-水 正己烷、甲醇、正丁醇
极性物质 正丁醇-水 甲醇、乙酸
　上表中是根据被分离物质的极性列出一些基本的可供参考的溶剂体系，它包括非水体系和含水体系。 　　溶剂系统的选择对于HSCCC分离十分关键。遗憾的是到目前为止溶剂系统的选择还没有充分的理论依据，而是根据实际积累的丰富经验来选择。通常来说，溶剂系统应该满足以下要求：溶剂系统不会造成样品的分解或变性样品中各组分在溶剂系统中有合适的分配系数，一般认为分配系数在0.2-5的范围内是较为合适的，并且各组分的分配系数值要有足够的差异，分离因子最好大于或等于1.5；溶剂系统不会干扰样品的检测；为了保证固定相的保留率不低于50%，溶剂系统的分层时间不超过30秒；上下两相的体积比合适，以免浪费溶剂；尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理尽量避免使用毒性大的溶剂。根据溶剂系统的极性，可以分为弱极性、中等极性和强极性三类。经典的溶剂系统有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等。在实验中，应根据实际情况，总结分析并参照相关的专著及文献，从所需分离的物质的类别出发去寻找相似的分离实例，选择极性适合的溶剂系统，调节各种溶剂的相对比例，测定目标组分的分配系数，最终选择合适的溶剂系统。
影响分离效果的因素
　　1. 固定相的保留值 　　在逆流色谱中，留在管中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素，高保留量将会大大改进峰分离度。 　　仪器对保留值的影响（外因） 研究表明：螺旋管支持件的自转半径r与公转半径R之比B值是一个影响两相互不混溶溶剂在旋转螺旋管内保留的关键因素。用大直径的支持件使值进一步提高，能导致亲水性溶剂体系的单向性流体动力学分布反向；反之，用小直径的支持件使值减小，能使疏水性溶剂体系的单向性流体运动方向反向，而介于疏水性和亲水性溶剂之间的中间极性溶剂，其两相分布状况则会受到离心力条件的影响。 　　溶剂体系物理因素对保留值的影响（内因） 　　溶剂体系的物理因素如溶剂的黏度对固定相的保留影响很大，低黏度的溶剂体系可望得到高的固定相保留，界面张力和两相间的密度差会对溶剂在临界点附近的分层时间产生较大的影响，一般为保证固定相保留值合适，溶剂体系的分层时小于30s。 　　2. 转速的影响 　　螺旋管的旋转速度对两相溶剂在流体动力学平衡时的体积比，也就是对固定相的保留值的影响很大，从而影响了分离效果。当然，并不是转速越快越好，一般对于分配得不是太好的溶剂体系，如两相体系带有氯仿的，还要固定相分层比较慢的两相体系，通常情况下转速越高，越易产生乳化现象。 　　3. 流速的影响 　　流动相流速也会影响两相的分布，一般情况下，流动相流速越大，固定相流失加重，但流速过慢会导致分离时间过长，从而造成对溶剂的浪费。 　　4. 温度的影响 　　温度的提高溶剂的黏度有很大的影响，一般提高温度会获得高的保留值，而相反降低温度则得到低的保留值，但一般温度不可能提高太多，因为所用的都是有机溶剂，沸点很低。 　　5. 相联检测技术 　　目前，可见光检测、紫外光检测技术在HSCCC中应用较多。但有时由于组分对可见光或紫外光无吸收，或是固定相的流失导致流出液乳化，故无法用常用光学检测器检测。现在己出现了HSCCC与质谱（MS）、电子电离质谱（EI-MS）、化学电离质谱（CI-MS）快速原子轰击质谱（FAB-MS）、热喷雾质谱（TSP-MS）和电喷雾质谱（ESI-MS）的联用。
技术发展
　　二十世纪六十年代，首先在日本，随后在美国国家医学研究院发现了一种有趣的现象：即互不相溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小孔径管子里分段割据，并能实现两溶剂相之间的逆向对流。Ito及其后来者在此基础上研究并设计制造出了一系列逆流色谱装置，早期的是封闭型的螺旋管行星式离心分离仪CPC（coil planet centrifuge），用于分离染料，蛋白质和细胞粒子。数年后Ito把流通机制引入到螺旋管柱体系中，使逆流色谱和现代色谱一样可以实现连续的的洗脱、分离、检测和收集，并建立了两个基本的流通体制。其中有在比较简单的流体静力学平衡体制HDES基础上开发的作为分析分离的CCC、用作制备分离的DCCC以及移位腔室CCC等。另一方面，以流体动力学平衡体制HDES为基础，研制出在重力场作用下的大制备量分离仪器和在离心力场作用下的分析型和半制备型分离仪器。
研究热点及发展趋势
　　近年来，溶剂体系的选择范围越来越宽泛，有人提出用超临界二氧化碳做流动相，利用它的高扩散性、低粘度、流体特性及环境友好等其他溶剂不可比拟的优势分离化合物，还有人提出用制冷剂做流动相的可能性。还有人提出将三相溶剂体系用于高速逆流色谱分离中，可以对宽极性范围的样品进行很好的分离。目前三相溶剂还只用于标准品混合物的分离， 　　还没能用于具体天然产物的分离，相信进行进一步的发展在复杂天然产物以及药物的分离中有很大应用前景。 pH区带逆流色谱是一种最新发展起来的制备色谱技术，它能使样品的负载容量提高10倍以上，即使含量很低的物质也能得到高度浓缩。它是在固定相和流动相中加入一对试剂——保留剂和洗脱剂，保留剂用来把样品中的各组分保留在管柱内，当含有洗脱剂的流动相以一定流速穿过固定相时，由于酸碱反应最终达到平衡。以保留剂在两相中的浓度比标度分配系数保留剂的分配系数，溶质的分配系数与标度值的差异决定了溶质的出峰时间，根据不同组分的Pka和疏水性的不同而实现分离。其色谱峰呈逐一连接的高度浓缩的重叠很少的矩形峰状，很像替代色谱的色谱峰形。 　　离子对逆流色谱是在固定相中加入适当的配体，以提高溶质在固定相中的保留值，改进峰分离度，已广泛用于天然药物中肽类成分、生物碱与氨基酸等的分离。 　　二元模式逆流色谱法以同一两相分配溶剂系统洗脱，既可用于正相洗脱也可用于反相洗脱。 　　HSCCC与质谱等其他技术的联用也是当前的研究热点，它把HSCCC分离的多样性与质谱的高灵敏度检测和结构分析特性良好地结合在一起，前景十分看好。为了克服HSCCC理论研究相对滞后的不足，有不少研究人员正从事理论研究，试图建立完善的理论基础来指导溶剂体系的选择，以期使HSCCC尽快从一种分离技术发展成为一门分离科学。 　　HSCCC一种独特的不用固态载体的液液分配色谱技术，是一种能实现连续有效分离的实用分离制备技术，能采用多种多样的溶剂系统对任何极性范围的样品进行分离，能实现从微克、微升量级的分析分离到上百毫克、数克量级的制备提纯，适用于未经严格处理的大量粗制样品的中间级分离，也能与质谱仪、红外光谱仪等分析仪器联用进行高纯度分析，应用前景十分广阔。

高速逆流色谱的独特优势：     
   
    多分离柱高速逆流色谱是一项新型的、基于液-液分配原理的色谱分离技术，它不需要固体载体，固定相和流动相都是液体。相对与传统的分离纯化技术，主要有以下几个优势：
 
      ◆低成本：一次性投入，不用柱填料，不用更换分离柱，使用不同的溶剂体系就可以分离不同的样品。使用分析纯试剂，仪器的运行和维护成本低；

      ◆高回收率：不存在因固态载体造成的吸附损耗、样品变性等问题，理论上样品回收率接近100％；

      ◆制备量大：分析型达到微克－毫克级，进样圈20ul;半制备型能达到毫克－克量级级，进样圈20ml；制备型设备进样量能达到克－100克量级，进样圈200ml；

      ◆高分离率：样品前处理要求低，允许进一些不溶的杂质，目标产物分离提取纯度可达99%以上；

      ◆应用范围广：固定相、流动相均为液体，有广泛的液－液分配系统可供选择，体系更换方便、快捷；

      ◆运转稳定：三分离柱串联、运转噪音小、稳定性高；有温控功能，能提高实验重复性；

      ◆操作便捷：分离周期短，分离中途仪器可暂停而不影响分离效果；

高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography，简称HSCCC) 是一种较新型的液—液分配色谱,由美国国立健康研究院(National Institute of Health, U.S.A.)Ito博土最先研制开发后由北京市新技术应用研究所在国内开展研发和推广工作。其原理是基于样品在旋转螺旋管内的互不混溶的两相溶剂间分配不同而获得分离，因而无须任何固体载体或支撑体，能达到在短时间内实现高效分离和制备，并且可以达到几千个理论塔板数。与其他柱色谱相比较，它克服了固定相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形施尾等缺点[3]。目前此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域[5]。我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。美国FDA及世界卫生组织(WHO)都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定，90年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。
1.      高速逆流色谱仪原理及特点
HSCCC利用了一种特殊的流体动力学(单向流体动力学平衡)现象。具体表现为一根100多米长的螺旋空管，注入互不相溶的两相溶剂中的一相作为固定相，然后作行星运动；同时不断注入另一相(流动相)，由于行星运动产生的离心力场使得固定相保留在螺旋管内，流动相则不断穿透固定相；这样两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。由于样品中各组分在两相中的分配比不同，因而能使样品中各组分得到分离。
2.      HSCCC的优点   
HSCCC主要具有以下几个方面的优点。
2.1 应用范围广，适应性好。由于溶剂系统的组成与配比可以是无限多的，因而从理论上讲HSCCC适用于任何极性范围的样品的分离，所以在分离天然化合物方面具有其独到之处。并因不需固体载体，而消除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和其它具有生物活性的物质。
2.2 操作简便，容易掌握。分离过程中对样品的前处理要求低，仅需一般的粗提物即可进行HSCCC的制备分离或分析。
2.3 回收率高。由于没有固体载体，不存在吸附、降解和污染，理论上样品的回收率可达100％。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。
2.4 重现性好。如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，那么多次进样，其分离过程稳定性都保持很好、峰的保留相对标准偏差也小于2%，重现性相当好。
2.5 分离效率高，分离量较大。由于其与一般色谱的分离方式不同，能实现梯度操作和反相操作、亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高。研究结果表明:一台普通的高速逆流色谱仪一次进样可达几十毫升，一次可分离近10g的样品。因此，在80年代后期被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究

关于高速逆流色谱的文献现在很多，近年来国内很多研究人员开始热衷于使用HSCCC。当然在分析方面的确不如HPLC，不过在一些样品的粗分离甚至精制上可以媲美制备型HPLC，但是HSCCC分离条件的摸索是个难题。
HSCCC在中草药分离上占有很大的优势，在制备量和成本上优于制备HPLC，但要熟悉溶剂的选择。
这也是我国在仪器领域中为数不多的还占据世界前沿的技术。

难道迪马也在做这方面的工作？

高速逆流色谱是连续液-液分配色谱，其固定相通过重力场和离心力作用保留在分离柱内，而流动相按液-液分配色谱的原理将要分离、制备的组分一一带出色谱柱外检测并收集。高速逆流色谱避免了固定相对被分离组分理化性质的影响，也避免了不可逆吸附。
  利用高速逆流色谱可从粗制品中一步制备获得高纯度单体，适合用于工业上大规模制备。也可广泛用于生化工程、医药、天然产物、环境分析、食品等到领域中的微量分析。
  聚四氟乙烯管缠绕在支架上形成多层螺旋管做分离管，共有三个分离管串联在一起，分离管由自转轴控制转速，而三个分离管又共同安装在带有公转轴的主机上。主机公转轴的转速可与自转轴的转速相同或不同。调节公转轴的转速和自转轴的转速使分离柱内固定相和流动相达到平衡后，就可进样到色谱系统中分离。
  高速逆流色谱分离原理：在B点主机公转的离心力与3根分离管自转的离心力方向相反，流动相与固定相混合在一起，固定相和流动按分配原理分配样品中的组分。
  高速逆流色谱旋转时影响固定相在分离管中的保留率，保留率越高分离效果越好。
            固定相占分离管的总容积-排出的固定相体积   
      保留率=────────────────────
                  固定相占分离管的总容积
  进入分离管流动相流动的方向可与主机转动的方向相同或相反。两者的方向相同，或者主机反方向转动，而流动相正方向流动，固定相保留率高，分辨率也高。同时，固定相的保留率与主机转速和流动相的流速也有很大的关系。
  高速逆流色谱对混合样品中组分的有交分离依赖于样品各组分分配系数的差异。影响组分分配的因素很多，也包括洗脱液体第的组成、pH值、离子强度等。在蛋白质的分离中，pH值的影响最大。