主题：【分享】微生物与灭菌教材

五、外界因素对微生物的影响
微生物的生命活动与外界环境有着极为密切的关系，适宜的外界环境，能促进微生物的生长繁殖；环境不适宜时，微生物的代谢活动也随着改变，引起微生物的变异或抑制，甚至死亡。在实际工作中，一方面可创造有利的条件，促进微生物的生长繁殖，检查产品中有无细菌的存在，有助于控制和提高产品质量。另一方面，即利用对微生物生长繁殖的不利因素，抑制或消灭微生物，以达到消毒灭菌的目的。本节着重讲述外界环境对微生物生长的不利因素。
1.温度和化学因素  温度和化学因素对微生物的生长繁殖影响极大，将在物理灭菌法和化学灭菌法中讲述。
2.pH值  pH值对微生物生长的影响，如表5-1所示。
表1  pH值对大多数微生物生长的影响
酸性条件    碱性条件    微生物生长情况
pH值=6～7
pH值=4～6
pH值=3～4
pH值=2～3
pH值＜1.5   
pH值=7～9
pH值=9～10
pH值=10～11
pH值＞12    生长最繁盛
生长良好
略受抑制，尚能生长
生长受严重抑制
不能生长
3.湿度  温度可以促使细菌生长，特别对霉菌繁育更快。因此防止湿度过大对于避免染菌霉败有一定的作用。
4.渗透压  微生物的细胞具有半透膜的性质，可以透水，但对于其他物质的透过则有选择性，低渗药液可使细胞膜膨胀，但高透药液可使细胞内水分渗出而处于脱水状态。所以一般微生物在浓盐溶液或浓糖溶液中不易生长繁殖，就是由于细菌细胞内水分渗出而脱水的缘故。如蔗糖是微生物的良好营养；单糖浆含蔗糖85%，为其等渗浓度9.25%的9倍多，却能保持不长菌；若浓度不够，容易长菌败坏。
六、有关名词解释
灭菌  系指杀死或除去所有微生物的繁殖体和芽胞，使之完全无菌。
消毒  系指仅仅杀灭病原微生物，使之不成为传染源。
杀菌  系指使用化学药品或物理因素，对微生物在短时间内起杀灭的作用。
抑菌  即抑制微生物繁殖体的生长及其繁殖。
防腐  系指防止或抑制微生物生长繁殖的方法。
无菌  系指没有任何活的微生物存在。

药剂卫生知识培训

一、药品卫生标准

药剂作为直接应用于人体的特殊商品对卫生学有着较高的要求。药剂被微生物污染，可能会使其变质、腐败，甚至失效（如口服液的爆瓶现象、糖浆剂的发霉变质）；也有可能危害人体（如被绿脓杆菌污染的眼膏可能使患者产生溃疡，甚至失明；应用染菌的注射液患者会出现败血症等）。因此，各国GMP对药品卫生都做了严格规定，以保证药品能安全、有效地应用于临床。

卫生部于1978年颁布《药品卫生标准》。并于1986年和1989上又做了相应的修改和补充。在以上基础上，对内用药、外用药及暂时未要求项下的各种剂型均作出明确规定。

二、药剂可能被微生物污染的途径

微生物无处不在，药剂尤其是液体药剂又为微生物的生长繁殖提供了必要条件，因此药剂极易被微生物污染。所以应该了解药剂被微生物污染的途径并采取了适当措施消除污染。从药材进厂到成品出厂的整个制备过程均可被微生物污染，其主要途径有：

①                原料药材。主要指植物药类和动物类药材，直接携带多种微生物和螨，且很多药材（如含糖量较高的根茎类药材和脂肪较多的动物类药材）有利于微生物和螨的生长繁殖；

②                辅助材料。如水、蜂蜜、淀粉等常用辅料均存在一定数量的微生物；

③                制药设备。如粉碎机、混合机、制丸机、压片机及各种盛装物料的料桶和器具等均有可能带入微生物；

④                环境空气。空气中有多种微生物存在，附着于尘粒上。

⑤                操作人员。工人的手、外表皮肤、毛发及穿戴的鞋、帽和衣服上都带有微生物；

⑥                包装材料。玻璃瓶、塑料袋、包装纸等可能带入微生物。

三、制药环境的空气净化

我国GMP对药品生产企业所处环境的空气、场地、水质等卫生条件均有严格要求。空气中含有多种微生物，也是微生物污染药剂的主要途径之一。由于空气中细菌多附着于5μm以上的尘粒上，因此制药车间净化空气除去尘粒，也就可有效地除去微生物。

（一）常用净化设备

1.非层流型洁净空调系统  净化厂房封闭式建筑，空气经滤过净化、蒸汽加湿、加热调温，并保持室压稍大于一个大气压，室温为18～26℃，相对湿度为45%～65%。他能除去大部分尘粒保证空气的洁净，达到一定洁净级别，而且有适宜的温度和湿度，创造一个舒适的生产环境。但非层流型净化空调装置送入的空气属紊流状气流，可使空气中夹带的混悬粒子迅速混合，由小粒子聚结成大粒子，也可使室内静止的微粒重新飞扬，而且室内死角处的部分空气出现停滞状态，故不易将尘除净，净化效果稍差。

2.层流型洁净净化系统  有较大型水平层流洁净室和小型层流净化工作台。经高效过滤器过滤的空气，以较高的速度从一面墙（壁）向对面墙（壁）层流流去，室内尘粒被气流带走（0.3μm 以上尘粒可除去99.97%），达到无菌要求。

（二）洁净级别划分

我国GMP第十四条按生产工艺和产品质量的要求划分净化级别，见下表

洁净级别标准

洁净级别	尘粒数/m3		活微生物/m3		换气次数
	≥0.5μm	≥5μm	沉降菌/皿	浮游菌
100级	3500	0	1	5	水平层流≥0.4m/s， 水平层流≥0.3m/s
10000级	350000	2000	3	100	≥20次/h
100000级	3500000	20000	10	500	≥15次/h
300000级	10500000	60000	15	1000	≥12次/h

（三）不同净化级别的适用范围

1.100级洁净厂房  适用于生产无菌而又不能在最后容器中灭菌的药品配液（指灌封前不需无菌滤过）及灌封；能在最后容器中灭菌的大体积（＞50ml）注射用药品的滤过、灌封；粉针剂的分装、压塞；

非最终灭菌药品直接接触药品的包装材料最终处理后的暴露环境

无菌原料药的精制、烘干、分装、混粉等的直接暴露环境。

2.10000级洁净厂房  适用于生产无菌而又不能在最后容器中灭菌的药品配液（指灌封前需无菌滤过）；能在最后容器中灭菌的大体积注射用药品的配液及小体积（<50ml）注射用药品的配液、滤过、灌封；

注射用药品原料药的精制、烘干、分装。

最终灭菌药品直接接触药品的包装材料的最终处理环境。

供角膜创伤和手术用滴眼剂的配制和灌装。

3.100000级厂房，注射剂浓配及采用密闭系统的稀配，非最终灭菌药品的轧盖、非最终灭菌药品直接接触药品的包装材料最后一次精洗的最低要求。

非最终灭菌口服液体药品的暴露工序，深部组织创伤外用药品、眼用药品的暴露工序，除直肠外的腔道用药的暴露工序。

4．300000级厂房  口服固体制剂的药品暴露工序；表皮外用药品的暴露工序；最终灭菌口服药品的暴露工序，直肠用药的暴露工序。

非无菌原料药的暴露区域的最低级别。

第二节  灭菌方法与无菌操作

灭菌法是指杀死或除去所有微生物及其芽孢的方法。一般可分为物理灭菌法和化学灭菌法。

一、F与F₀值在灭菌中的意义与应用

（一）D值与Z值

K 2.303

（1）在一定温度下，微生物死亡速度属一级动力学过程，符合下列方程：

lgN_t= -      t+ lgN₀                       

2.303K

式中，N₀—开始时的微生物数量；N_t—t时残存的微生物数量；t—时间；K—速度常灵敏。上式可转换为：

t=      （lgN₀ - lgN_t）           

D的含义是：在一定温度下杀死被灭菌物品中微生物的90%所需的时间。将N_t=10%N₀代入“式2-2”中，得D=2.3.3/K。因此，可将D看作是被灭菌物品中降低微生物一个数量级所需的时间。

T1-T2 LgD2-lgD1

（2）对特定的微生物在一定的条件下，变换温度，可得到不同的D值。将lgD（作纵轴）对温度（作横轴）作图，在一定温度范围内，二者呈线性关系。将Z定义为斜率的负倒数，即Z=          ，Z值的含义为降低一个lgD值所需升高的温度数，单位为度（℃）。

（二）F值与F₀值

T-T0 Z

（1）F值的数学表达式为：

F=△t∑10                 

式中△t—测量被灭菌物品温度时间间隔，一般为0.5～1.0min或更小；T—各时刻测得的温度值；T₀—参比温度。

若设定灭菌后被灭菌物品中内微生物残存数N_to 10^-6即达到可靠的灭菌效果，且D=0.3.3/K，代入“式2-2”，就可将在一定温度（T）下杀死全部微生物所需的时间（t）称为F值，即：

Fr=Dr（lgN₀ – lg10^-6）         

    （2）F₀值  根据F值的数学表达式，对于湿热灭菌的参比温度规定为121℃，并假设特别耐湿热微生物指示剂（嗜热脂肪芽孢杆菌）的Z值为10℃，则：

T-121 Z

                          F₀=△t∑10                   

此式说明，F₀表示Z值为10℃时，一定灭菌温度（T）产生的灭菌效果与12℃产生的灭菌效力相同时所相当的时间（min）。即将被灭菌物品各不同受热温度均折算到与湿热灭菌121℃产生的灭菌效力相同时所相当的灭菌时间。

例如，被灭菌物品于100℃时放入灭菌器开始继续升温灭菌，每隔0.5min测定一次实际温度,分别为100、102、104、…115℃，到达115℃时保持30min，将数据代入“式2-5”中，求得F₀=8.1min。

为了确保F₀ 值≥8，所需的灭菌时间：115℃，30分钟；116℃，25分钟；117℃，20分钟；121℃，8分钟。

在热压灭菌过程中，由于灭菌器预热时间，升温速度、物料体积、物料含菌量等因素的不同往往影响灭菌效果。F₀值的计算，是在很短时间间隔测定实际灭菌温度，对于验证灭菌效果有重要意义，如美国药典规定输液剂灭菌F₀≥8。为确保灭菌效果，实际操作应将计算的F₀增加50%。如规定F₀=8，则在实际生产中应控制在F₀≥12。

二、物理灭菌法

物理灭菌法系指采用加热、辐射等物理手段达到灭菌目的的方法。

（一）加热灭菌法

加热可破坏微生物中酶、蛋白质和核酸，导致微生物死亡。加热灭菌又分干热灭菌法和湿热灭菌法。在同一温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好。主要是因湿热灭菌时，有水分存在，蛋白质容易变性。水分又易使微生物膜壁润湿，湿热的穿透力比干热大。

1.干热灭菌法  常用的有火焰灭菌法与干热空气灭菌法两种。

（1）火焰灭菌法  系指用火焰直接烧灼以达到灭菌的方法。将手术刀、镊子、药刀、研钵、玻棒、接种环等通过火焰几秒钟即可。而搪瓷盘或桶等较大的物品可倒入许乙醇直接点燃灭菌。

（2）干热空气灭菌法  系指用烘箱等设备用高温干热的空气灭菌的方法。一般需170～180℃维持1h以上灭菌效果才可靠。或250℃至少45分钟、160～170℃维持2h以上。本法适用于玻璃器皿、搪瓷容器及油性和惰性辅料，如液体石蜡、油类、脂肪类、滑石粉、活性炭等。

干热灭菌应保证物品灭菌后的无菌保证水平SAL≤10^－6 ，即药品被污染的概率小于十万分之一，干热过度杀灭后的SAL≤10^－12 ，此时物品一般无需进行灭菌前污染微生物的测定，250℃，45分钟可除去包装容器及灌装器具中的热原物质。

采用干热灭菌时，被灭菌物品应有适宜的装载方式，不能排列过密，以保证灭菌的有效性和均一性。

验证时常用的生物指示剂：枯草芽孢杆菌孢子（灭菌），不小于1000单位的大肠埃希菌内毒素（除热原）。

（3）高速热风灭菌法  在安瓿侧面吹入速度为30～80m/s，190℃的高速热风，2ml安瓿液温3min内升温至140℃，呈现强杀菌效果，且药物在较短时间内被破坏的也较少，此法主要用于小容量安瓿的灭菌。

2.湿热灭菌法  本法是利用饱和水蒸气或沸水等杀灭菌微生物的方法。

2005版中国药典：湿热灭菌条件通常采用121℃，15 min；121℃，130min；116℃，40 min的程序，也可采用其他温度和时间参数，但必须保证无菌保证水平SAL≤10^－6，对热稳定的，可采用过度杀灭法，其SAL≤10^－12。热稳定性差的产品的标准灭菌时间F₀值不应小于8分钟。如果产品的热稳定性很差时，可允许湿热灭菌的F₀值小于8分钟，但应在生产的全过程中，对产品中污染的微生物严加监控，并采取各种措施降低微生物污染水平，确保被灭菌产品达到无菌保证水平。

采用湿热灭菌时，被灭菌物品应有适宜的装载方式，不能排列过密，以保证灭菌的有效性和均一性。验证时常用的生物指示剂：嗜热脂肪芽孢杆菌孢子。

（1）热压灭菌法  本法系在热压灭菌器内，利用高压饱和水蒸汽杀死微生物的方法。在高压下，水的沸点相应升高。由于热压灭菌器为密封设备，随蒸汽量的增加而使灭菌器内压力增大，则温度也升高，故有很强灭菌效力。被公认是最可靠的灭菌方法（F₀=8～12）。但灭菌应以保证药物不被破坏失效为前提，所以很多药剂不宜采用热压灭菌。热压灭菌法所需的温度与温度相当的压力和时间。见下表

热压灭菌温度、压力与时间

温度（℃）	绝对压力（kpa）	表压（kpa）	灭菌时间（min）
115.5 121.5 126.5	166.72 196.14 235.37	68.65 98.07 137.30	30 20 15

常用的热压灭菌有：小型的手提式热压灭菌器、大型的卧式热压灭菌器等。热压灭菌法适用于耐热药的及其水溶液（多数输液剂）、手术器械及用具等物品的灭菌。热压灭菌器使用时应注意以下问题：①检查仪表。使用前应先检查压力表、温度表、安全阀等部件；②排尽空气。饱和水蒸气热压灭菌效力强于湿饱和蒸汽和过热蒸汽。为保证饱和蒸汽的获得，首先开启放气活门（卧式灭菌器放气活门在下部）将灭菌器内空气排尽，使压力与温度相符；③准确记时。一般先预热15～20min，再升压和升温，达到预定压力和温度后开始计时；④安全开启。灭菌完毕后，停止加热，待压力表指针降至0，打开上放气阀，排尽器内蒸汽，待温度降至40℃以下，再缓缓开启门盖。不可快速放气，骤然减压会导致容器爆裂和药液外溢。

（2）流通蒸汽灭菌法和煮沸灭菌法  系指在常压下用100℃的水蒸汽或用水煮沸以杀死微生物的方法。灭菌时间一般为45～60min，可杀灭繁殖型细菌，但不一定能完全杀灭芽孢，适于含有抑菌剂药液的灭菌，1～2ml的注射剂及不耐高热的品种灭菌。

（3）低温间歇灭菌法  系指将灭菌的物品先用60～80℃加热1h以杀死繁殖菌，然后再室温或孵箱保温24h，以使芽孢发育成繁殖体，再重复加热和放置操作2～3次，至全部灭菌。此法适于必须采用加热灭菌但又不耐较高温度的药品。

（二）滤过除菌法

系指使药液通过除菌滤器中的适宜滤材，机械滤除（阻挡）活的或死的细菌，而得到不含细菌药液的方法。主要用于对热不稳定的药物溶液、气体、水的除菌。供灭菌用的滤器，要求能有效地从溶液中除净微生物，溶液顺畅地由滤器通过，滤液中不落入任何不需要的物质，滤器容易清洗，操作简便。

一般繁殖型微生物大小约1μm，芽孢约为0.5μm。对于以过筛作用滤过的滤器，例如纤维素酯膜滤器，其孔径大小必须小到足以阻止细菌和芽孢进入滤孔之内，孔径约为0.2μm。靠阻留于孔道内或静电作用的滤器孔径可稍大于所要滤除的颗粒，但压力过大或波动，颗粒就有被挤过的可能。通常用测定孔径的方法，是用大小为0.7μm左右的灵菌（B.prodigilsus）混悬液滤过，滤液通过培养实验，观察有无灵菌生长。常用除菌滤器有微孔薄膜器，摺叠式纤维素滤棒，一般选用孔径0.22μm，才可有效地阻挡微生物及芽孢的通过。滤过除菌法适于不耐热的药物溶液，尤其是一些生化制剂。在除菌过程中，同时除去一些微粒杂质。加压和减压滤过均可采用，但加压滤过较安全适用。本法必须配合无菌操作技术，成品必须经无菌检查合格后方可出厂。

常用的滤器有垂熔玻璃滤器和微孔滤膜滤器。一般药液先经粗糙、精滤（砂滤棒、多孔聚乙烯、聚氯乙烯滤器、白陶土滤器、G₄、G₅垂熔玻璃滤器、0.45μm左右的微孔滤膜）后在无菌环境下，再用已灭菌的G₆垂熔玻璃滤器或孔径0.22μm以下微孔滤膜除菌。

一般用微孔滤膜作过滤材料，滤膜材质依过滤物品的性质及过滤目的而定，分亲水性和疏水性材料。更换品种应先清洗滤器，再更换滤膜。除菌效率用缺陷假单孢菌（每平方厘米的面积上不少于10⁷个），为保证过滤除菌效果，应控制过滤前滤液的污染水平，可使用2个过滤器串联过滤，或在灌装前用过滤器进行再次过滤。除菌过滤器的使用时间一般不超过1个工作日，除非经过验证。

（三）紫外线灭菌法

是指用紫外线照射杀灭微生物的方法。一般用于灭菌的紫外线波长是200~300nm，灭菌力最强的波长是253.7nm。紫外线作用于核酸蛋白促使其变性，同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧，从而起共同杀菌作用。紫外线进行直线传播，可被不同的表面反射，穿透力微弱，但较易穿透清洁空气及纯净的水。因此本法适用于照射物体表面之灭菌、无菌室的空气及水的灭菌；不适用于药液的灭菌、固体物质深部的灭菌；普通玻璃可吸收紫外线，因此装于玻璃容器中的药物不能用此法灭菌。紫外线对人体照射过久，会发生结膜炎，红斑及皮肤烧灼等现象，故一般在人入室前开启紫外线灯1~2小时，关闭后人才进入洁净室。如果必须在人进去后仍要开紫外线灭菌，则人的皮肤及眼睛应有有效的防护措施。一般在6~15m³的空间可装置30瓦紫外线灯一盏，离地面2.5~3m为宜。

用紫外线照射灭菌时要注意下列问题：

1、紫外线的杀菌力，随使用时间增加而减退，一般使用时间达到额定时间70%时应更换紫外线灯管，以保证杀菌效果。国产紫外线灯平均寿命一般为2000h。

2、紫外线的杀菌作用随菌种不同而不同，杀霉菌的照射量要比杀杆菌大40~50倍。

3、紫外线照射通常按相对湿度为60%的基础设计，室内湿度增加时，照射量应相应增加。

4、紫外线灭菌效果与照射的时间长短有关，这需要通过验证来确定照射时间。

5、紫外照射灯的安装形式及高度，应根据实际情况,参考使用说明决定。

灭菌方法的验证采用生物指示剂挑战试验，生物指示剂多用枯草芽孢杆菌。

（四）微波灭菌法

微波是指频率在30~3000MHz之间的电磁波。水可强烈地吸收微波，使其极性分子转动，分子间的磨擦而生热，且升温迅速，靠热力而灭菌。在数十秒至几分钟之内可达100～150℃，并全部杀死液体中的微生物，适于水溶性注射液的灭菌。另外，固体药材饮片及固体制剂（丸剂、散剂、胶囊粉等）也含少量水分，微波能穿透到固体内部，由表至里被均匀加热，而起干燥、灭菌的作用。多用于口服液体制剂的灭菌，有望用于注射液的灭菌。但可能对某些药品的PH值、含量、颜色有影响。



（五）辐射灭菌法

辐射灭菌是应用γ射线、β射线杀灭细菌的方法，又称电离辐射，前者由钴-60或铯-137发出，穿透力强；后者由电子加速器产生，带电荷，穿透力弱，灭菌效果差。常用⁶⁰C_O辐射源放射γ射线而杀菌，被灭菌物品湿度仅有几度的变化，其灭菌的机理是γ射线直接作用于微生物的蛋白质、核酸和酶等，促使化学键断裂，杀死微生物；又可间接作用于微生物体内的水分子，引起水的电离和激发，生成自由基，再作用于微生物活性分子，使微生物死亡。对于辐射灭菌，无芽胞菌比有芽胞菌敏感得多；无芽胞菌中革兰氏阴性菌比阳性菌敏感；而病毒敏感性很差。

辐射灭菌的特点是不升高灭菌产品的温度，穿透性强，适合于不耐热药物的灭菌，医疗器械、高分子材料、包装材料等灭菌。但是造价昂贵，对房间有特殊的要求。对某些药品可能产生药效降低，产生毒性物质或发热物质，使用辐射灭菌还应注意安全防护措施。

灭菌剂量一般可用2.5×104GY(戈瑞)。由于γ射线穿透力极强，可用于密封安瓶和整瓶甚至整箱已包装的药品的灭菌。此法早已为《英国药典》（1998），《日本药局方》十三版所载。我国有些企业亦有用⁶⁰C0对某些中药和医疗器械进行灭菌。

三、化学灭菌法

化学灭菌法系指用化学药品来杀灭微生物的方法。同一种化学药品的低浓度时呈现抑菌作用，而在高浓度时则能起杀菌作用。其杀菌机理可能是：能使微生物蛋白质变性死亡，或与酶系统结合影响代谢，或改变膜壁通透性使微生物死亡等。常用的方法有消毒剂消毒法和化学气体灭菌法等。

（一）消毒剂消毒法

消毒是指杀死病原微生物的方法。但化学消毒剂大多仅能杀死微生物的繁殖体而不能杀死芽孢，能控制一定范围的无菌状态。可将消毒剂配成适宜浓度，采用喷淋、涂擦或浸泡等方法对物料、环境、器具等进行消毒。常用的化学消毒剂有0.1%～0.2%苯扎溴铵溶液、3%～5%的酚或煤酚皂溶液、75%乙醇等。常用于物体表面灭菌。但要注意其浓度不要过高，以防止化学腐蚀作用。洁净室的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、车、桌、椅等表面以及人体双手（手套）在环境验证及日常生产时，应定期清洁并用消毒剂喷洒，无菌室用的消毒剂必须在层流工作台中，用0.22μm的滤膜过滤后方能使用。

（二）化学气体灭菌法

系指利用化学药品的气体或产生的蒸汽进行杀灭微生物的方法。

1.环氧乙烷灭菌法  环氧乙烷灭菌法是利用环氧乙烷气体进行杀菌的方法。它是一种传统的灭菌方法，可应用于工衣灭菌、不耐加热灭菌的药品、医用器具、设施、设备等的灭菌。环氧乙烷灭菌系统，主要有下列四项互相制约的重要因素影响灭菌效果：

1、温度；2、湿度；3、气体浓度；4、灭菌时间。

因为环氧乙烷是易燃易爆物质，明火可以引起燃烧，同时由于气体分解还可能引起爆炸，环氧乙烷灭菌中应十分注意安全问题。

环氧乙烷具有非常强的渗透和扩散能力，其灭菌的机理主要是强氧化，其分子作用于菌体后，能与菌体蛋白、核酸和酶中的—COOH、—NH₂、—SH、—OH等基团起反应，而使菌体死亡。因此具有杀菌谱广，灭菌能力强的特点，对微生物的繁殖体、芽孢有较强的杀灭效果。虽然环氧乙烷在高浓度时有刺激性臭味和毒性，但属中度毒性，一般可以很快挥发，不会在系统内表面残留余毒。

灭菌机理主要是它的烷基的取代性质、细菌蛋白质分子中的-cooH、-NH₂、- OH、SH基上的氢原子被环氧乙烷的羟乙基基团所取代而使菌体细胞的代谢产生不可逆性的破坏。

CH₂-CH₂ +R-SH→R-S-CH₂-CH₂OHo

        R-SH代表含巯基的蛋白分子。

用环氧乙烷气体灭菌的程序，大致为将灭菌物品置于灭菌器内，减压排除空气，预热，环氧乙烷气体采用混合气（一般环氧乙烷气体含10-20%，二氧化碳含80~90%），在减压下输人混合气体，保持一定浓度、温度和湿度，经过一定时间后，抽真空排除环氧乙烷气体，然后送入无菌空气置换环氧乙烷气体，直至换净。

环氧乙烷室温下为气体，环氧乙烷分子易穿透塑料、纸板或固体粉末，因此可用于塑料包装的原料粉末、散剂、颗粒等固体药料及其他固体器具的灭菌。该法灭菌耗时较长，费用较高是其不足。

2.甲醛等蒸汽熏蒸法  采用甲醛、丙二醇或过氧醋酸等化学品，通过加热产生蒸汽进行空气环境灭菌。

(1)、计算房间体积，按10g/m³的比例称出甲醛。

(2)、将甲醛倒入甲醛发生器或加热盘或烧杯中，并放好加湿用水，必要时还需加入高锰酸钾（2~3g/m³），然后加热（甲醛发生器用蒸汽加热，加热盘或烧杯用热水盛入其中加热）使其蒸发成气体。

(3)、灭菌流程：空调器停止运转→ 启动甲醛气体发生器或在加热盘中加热甲醛  →让甲醛气体扩散约30分钟→ 启动空调器让甲醛气体循环约30分钟 →停止空调器，房间熏蒸消毒，时间不少于8小时 → 房间排气，用新鲜空气置换约2小时→ 恢复正常运行。

当相对湿度在65%以上，温度在24~40℃时，甲醛气体的消毒效果最好。

甲醛消毒灭菌的气体发生量、熏蒸时间、换气时间等应以验证结果来最后确定。也有报导过氧乙酸用于车间的室内灭菌，效力比相同浓度的甲醛大两倍半，对粘膜无刺激性，对木、金属制品、医疗器械无影响。

3、臭氧消毒法

臭氧（O₃）的消毒原理是：臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧（O₂）和单个氧原子（O），后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用，臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将其杀死。多余的氧原子则会自行重新结合成为普遍氧分子（O₂），不存在任何有害残留物，故称为无污染消毒剂。它不但对种种细菌（包括肝炎病毒、大肠杆菌、绿脓杆菌及杂菌等）有极强的杀灭能力，而且对霉菌也很有效。

生产臭氧的原料主要是电能和空气，一般通过高频臭 氧发生器（电子消毒器）来获得，消毒时，直接将臭氧发生器置于房间中间即可。

臭氧消毒效果的验证中需确认和校正的臭氧发生器技术指标有：臭氧产量、臭氧浓度和时间定时器，并通过验证检查细菌数来确定消毒时间。

四、无菌操作法

系指药剂生产的整个过程均控制在无菌条件下进行的操作方法。

某些药物若采用加热等方式灭菌则导致成分分解失效；为保证注射剂等灭菌效果，避免污染严重出现热原反应；软胶囊、滴丸等剂型为避免成品不便灭菌的麻烦，均应采用无菌操作。

无菌操作室应达到GMP的规定，为达无菌的要求可采取综合措施：

①    应采用层流洁净空气技术；

②    可采用甲醛等蒸汽熏蒸法消毒和紫外灯灭菌法进行空气环境灭菌；

③    室内用具、墙、桌等暴露面用消毒剂喷、擦消毒；

④    其他物品可热压或干热法灭菌；

⑤    操作人员衣、帽、鞋、手等消毒及灭菌。

无菌操作室应定期进行菌落检查。一般采用培养皿暴露20~30min，37℃培养48h，每只培养皿内不超过3个菌落为合格。

第三节  药剂的防腐与防腐剂

微生物有水分及其他适宜条件就可以繁殖，即使像含较少水分的蜜丸，由于含较多蜂蜜，也易使霉菌繁殖超标。固体药剂所含水分较少，不利微生物繁殖，只要采用适宜灭菌方法就可以达到目的。在贮藏、使用过程中就不会出现卫生学不合格的问题。而液体药剂则易被微生物污染，所以除采用适当方式灭菌外，可加防腐剂以抑、杀微生物。

防腐剂，又称抑菌剂，系指能抑制微生物生长繁殖的物质，常用的防腐剂有：

1.苯甲酸与苯甲酸钠  为常用的有效防腐剂，一般用量为0.1%～.25%。苯甲酸水溶性较差，而苯甲酸钠水溶性好，易溶解，应用方便。但由于防腐机制是其分子型的苯甲酸透入菌体膜壁而起效（离子型无效），所以不论使用苯甲酸或苯甲酸钠，都应在pH4以下的药液中使用。电离平衡使之绝大部分以分子型存在，故防腐效力较好。若pH升高，则应加大用量（以保证分子型达到有效抑菌浓度）。pH＞6则防腐效果不确切。

2.对羟基苯甲酸酯（尼泊金类）  有甲、乙、丙、丁四种酯，抑霉菌作用较强，一般用量为0.01%～0.25%。在酸性、中性及弱碱性药液中均有效。但随着pH的升高，在碱性药液中，由于酚羟基的解离及酯的水解而使尼泊金防腐力下降。各种酯单用即可，若几种酯合用效果更佳。由于酯类在水中溶解度较小，可先用热水将尼泊金搅拌使之溶解后加入；或取尼泊金先溶解于少量乙醇中，再边搅边加，加入药液中。

3.山梨酸与山梨酸钾  山梨酸的分子结构式为CH₃—CH=CH—CH=CH—COOH，常用浓度为0.15%～0.05%。对细菌和霉菌均有较强抑菌效力。特别适用于含有聚山梨酯的液体药剂防腐（而上述两类防腐剂在含聚山梨酯的液体药剂中，分子型分子被聚山梨酯所形成的胶团乌黑从而推动防腐效力）。

4.其他  含20%以上乙醇、含30%以上的甘油、中药中很多挥发油及0.1脱水醋酸等均有防腐效力。此外注射剂中常加甲酚、苯甲醇等作防腐剂之用。

离 了微生物，人类的生活也不会多姿多彩