主题：【分享】凝胶色谱调料分析

分离亲水气单胞菌外毒素的
功能高分子凝胶色谱填料
摘要  由丙烯 酰胺 和甲叉丙烯 酰胺 在水 油悬 液中共 聚得 到聚丙烯 酰胺凝胶 Z S P， 并用 I R、 溶
剂吸收 实验等对合成 的 Z S P的结构进 行了确证 。以商 品葡聚糖凝 胶色谱 S e p h a d  d e x — G1 0 0为对
照 ， 研究 了 ZS P 一 1 0对 中华鳖致 病的亲水气单 胞菌外毒素蛋 白的分 离性能 ， 结果 表明经 S e p h a d e x — 
G1 0 0和 Z S P一 1 0提纯的外毒素蛋白均保留了生物活 ( 毒) 性 ， 纯度高 。 从 S DS — P AGE分析结果 ， 可以
认为经提纯的毒素蛋 白是分 子量 为 3 2 KDa的纯品。与 S e p h a d e x — G1 0 0凝胶相 比， 聚丙 烯酰胺凝胶
色谱填料 Z S P一 1 0对 蛋 白质 的回收率更 高， 且成本低廉 ， 不易染菌 ， 是具有 良好 的应 用前景 的蛋 白
质分离色谱填料。 
关键词 ： 亲水气 单胞菌外毒素  聚丙烯酰胺凝胶
1  前言
在生物技术制取蛋 白质 的多级纯化过程中， 液相色谱被指定为一个必须步骤 ， 这表明操作条件温和、 又具有分子水平分离能力的液相色谱为开创现代生物大分子化学树立了一个里程碑。在液相色谱 中， 无论是哪一种层析方法 ， 分离介质 的性能都是分离效果 的首要决定 因素。目前所使用的多糖类蛋白色谱分离存在的普遍存在易染菌、 回收率低 、 成本高等问题 。开发高效的蛋 白分离介质受到国内外学者的广泛关注。蛋白分离层析介质 的发展趋势可以认为是对以天然大分子为母体 的层析介质不断地进行合成工艺改进 ， 提高性能 ， 使老产品更新换代； 同时大力开发以合成高聚物为骨架 的具有优异性能的新一代产品。 亲水气单胞菌在 自然界尤其在水体环境中分布甚广， 属弧菌科， 能引起人和动物的多种疾病n  ， 特别是水生动物暴发性传染病 ， 此病在我
国东南各地广泛流行 ， 尤 以水温较高的夏秋季为剧， 导致水生养殖鱼类大量死亡， 给渔业生产造成重大经济损失 矗  。 
亲水气单胞菌在习惯上被认为是条件致病菌 ， 随着细菌本身的研究的深入 ， 这一认识正在被修正 。已有报道该菌的 O抗原、 菌毛及一些表 面的非特异性粘附因子与该菌的致病性有关“  。 然而， 更多的报道指出致病侏能产生细胞外毒素 ， 而毒素与致病关系密切 ~ 7  。 但是关于毒素的种类和性质诸说不一 ， 未有定论。 我们用自制的凝胶色谱介质对 中华鳖致病的亲水气单胞菌素进行了分离。 
2 实验部分
2 ． 1 菌种
亲水气单胞菌菌株从广东省东莞市某养殖场患病的中华鳖中分离鉴定， 取材选取濒死新
2 ． 2 细菌培养
亲水气单胞菌菌株接种合成培养基 中， 摇床培养 3 5 ℃， 1 0 0  r ／ mi n， 2 4  h。 培养物经 4_ C， 1 O  0 0 0  r ／ mi n离心 3 0  mi n ， 取上清液。 将此上清液对小 白鼠( 体重 1 8 ~2 2  g ) 腹腔进行注射( 剂量为 0 ． 4  ml ／ 只) ， 确证其生物活性 。 
2 ． 3  聚丙烯酰胺凝胶色谱填料 Z S P的合成在 甲 苯 和 三 氯 甲烷 溶 剂 中加 入 少 量Twe e n 一 8 0和 1  9 ／ 6 聚乙烯醇 ， 滴加丙烯酰胺和甲又丙烯酰胺水溶液 ， 5 0 V水浴恒温 ， 滴加完毕待分散均匀后加入适量过硫酸铵， 待反应完成后 ， 
撤去水浴 ， 体系 自然冷却至室温， 减压抽滤 ， 真空干燥 ， 筛选出 2 0 0 ~3 0 0目产物备用。 
2 ． 4  红外分析： 采用布鲁克 EQUI NOX  5 5傅里叶变换红外光谱仪 ， 波数范 围为 4 0 0 ~4  0 0 0 c m～， 样品采用 KB r压片法进行测试。 
2 ． 5 溶剂吸收实验
将干燥至恒重 的 0 ． 1 ～0 ． 2  g  Z S P聚合物凝胶置于一特制的底部带有多孔玻璃砂板的试管中， 在室温下置于溶剂 ( 水) 中浸泡 2 4  h。试管用橡胶盖密封 ， 放到一离心管内， 用 2  0 0 0 ~4 0 0 0  r ／ mi n离心 1 5  mi n除去过量的溶剂 ， 将带
有溶胀剂的树脂的试管迅速转移到密闭的烧瓶中称重。溶剂吸收量用 1  g干树脂 吸收的溶剂重 量来表 示 。 
2 ． 6 毒素的提纯
2 ． 6 ． 1 硫酸铵盐析
用 Na OH调节细菌培养物上清液至 p H  6 ，  再加入硫酸铵至 7 O  的饱和度 ， 4 ℃静置 4  h，  1 0  0 0 0  r ／ mi n， 4 ℃离心 3 0  mi n， 去上清液， 沉淀溶于洗脱缓冲液 中， 对相同缓冲液透析过夜 ， 将透析后的样品用 P EG2 0  0 0 0进行浓缩 ， 即为粗提毒素。 
2 ． 6 ． 2  S e p h a d e x  G一 1 O 0凝胶过滤
将粗提 毒素 于 4 ℃装 S e p h a d e x  G1 0 0柱( P h a ma c i a产品， 1 ． 6×5 0  c m， 平均液及洗脱液均为 5 0  mmo l ／ L  Tr i s — HC1 ， p H  7 ． 8 ) ， 流速为 1 2  ml ／ h， 每管收集 4  ml ， 用紫外检测仪 2 8 0  n m进 行检测， 合并生物活性部分 ， 冻干浓缩。 
2 ． 6 ． 3  Z S P 一 1 0凝胶过滤 将 粗 提 毒 素 于 4 n C装 交 联 度 为 1 O  9 ／ 5 的Z S P 一 1 0 柱 ( 自制 ， 1 ． 6 ×5 0  c m， 平衡液及洗脱液 均 为 0 ． 2  mo l ／ I  Na Ac — HAc ， p H5 ． O ) ， 流速为1 2  ml ／· h， 每管收集 4  ml ， 用紫外检测以 2 8 0  n m进行检测 ， 合并生物活性部分， 冻干浓缩 。 
2 ． 7  SDS— PAGE采 用 La e mml i 不 连续 S DS — P AGE系统 ，  按常规方法在小型蛋白电泳仪上进行 1 0 0  V恒压电泳约 3  h。 所用分离胶浓度为 1 2  9 ／ 6 ， 浓缩胶浓度为 4  9 ／ 6 ， 用考马斯兰法染色。 
2 ． 8 小 白鼠毒性试验小 白鼠体重 1 8 ～2 2  g， 每组 2只， 分别腹腔注射 0 ． 4  ml 毒素样品。 
3 结果与讨论
3 ． 1  I R分析
图 1  聚丙烯酰胺凝胶填料的 I R谱图
图 1是 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 渗 透色 谱填 料  而引起的。 3 1 8 8  c m 处的强峰是 N— H伸缩振动Z S P 一 1 0的红外谱图。3 3 9 4 c m 处宽而强的峰是  吸收峰。 2 9 3 2  c m  和 2 7 8 1  c m  处的强峰是 CH 一OH伸缩振动的谱带 ， 由样 品中残留水分存在  基团中不对称和对 称 C— H伸缩振动峰。1 4 0 0  c m～， 1 3 0 0 c m～， l l 0 0 c m 和 1 0 0 0 c m。附 近的峰 是 C— N伸缩振动和一 NH变形振动引起的。6 2 7  c m  处的峰是 N— H面外变形吸收峰。 
3 ． 2  Z S P树脂的吸水率
图 2是 Z S P树脂吸水率一交联度曲线。 很明显， 在交联度为 5  ～2 0  的范围内树脂 的吸水率与交联度成正 比。 由此可推测， 在所合成 的聚合物中交联点的分布是 比较均匀的。  O0  5 ．o o％  I o． 00 ％  l 5 ． O0 ％  2 0． o(  2  5 |t ) 儡 
空娃度 图 2  Z S P树脂吸水率一 交联度 曲线
3 ． 3 毒素的纯化
粗提毒素经 S e p h a d e x- -Gl O 0凝胶色谱柱 纯化后 回收率为 1 8 ． 8 3  ， 经交联度为 1 0  的聚 丙 烯 酰 胺 Z S P 一 1 0柱 纯 化 后 回 收 率 为 6 8 ． 0 5  ， 洗脱液蛋峰分别为图 3和图 4 。 毒素的 S e p h a d e x — G  1 0 0层析
3 ． 4  SDS— PAGE
经 S e p h a d e x—G  1 0 0和聚丙 烯酰胺 Z S P一  1 0柱纯化后的毒素进行 S DS — P AGE， 考马斯兰 图 5  S e p h a d e x纯化 S DS — P AGE  行 M： 分子量标准 ， 行 A：  粗提毒素 ． 行 B： 提纯毒素 1 0天左右即会滋生霉菌， 不能再重复使用。而
Z S P 一 1 0 在 同样的条件下可保存半年。 提纯毒素 经浓缩后注射小 白鼠， 2 4  h后小 白鼠死 亡， 可 以认为两种凝胶色谱柱均保留了外毒素蛋白质 的生物 活性 。  图 6  ZS P 一 1 0纯化 S DS — PAGE 行 M： 分子量标准， 行 A；  粗提毒素 ， 行 B ： 提纯毒素
结论  1
由丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺在水油悬液中 共 聚得 到交 联度 为 1 0  的 聚丙 烯 酰胺 凝胶  ‘  Z S P 一 1 0 。Z S P 一 1 0对使 中华鳖致病 的亲水气单 胞菌外毒素蛋 白的分离性能 良好 ， 保留了生物  ．  活( 毒) 性， 纯度 高。 从 S D S — P AG E分析结果 ， 可 以认为经提纯 的毒素蛋白是分子量为 3 2  KDa  5  的纯品。与 S e p h a d e x — G1 0 0凝胶相比， 聚丙烯 酰胺凝胶色填料 Z S P一 1 0对蛋 白质 的回收率更  6  高， 且成本低廉 ， 不易染菌 ， 是具有 良好的应用 前景的蛋白质分离色谱填料。  7 群体反应性抗体( P RA) 高的免疫吸附治疗于 颖 ，