msher wrote:
好!!!真实用!!!
“回收的载体片段:回收的PCR产物片段=1:10 ,一般取前者0.3pmol,后者取0.03pmol。”
是不是应该前者0.03,后者0.3啊?
已经改了,谢谢!
昨天14个测序结果出来,全部是阳性克隆。两边是载体的序列,中间是插入的目的片段。回顾自己的实验现补充几点。
做转化时,也要进行对照.
设4个:
A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.
B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒
C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.
D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.
就上面的对照简要说一下我的结果。转化后第二天可见14个标本的平皿上长了很多克隆,约100个左右,我用的是直径6cm的板子,所以仍显较多,(我是先挑半个克隆并标记好行PCR鉴定后再对另外的一半进行摇菌抽提质粒),较难挑克隆,所以铺皿时不用离心,直接用100微升的铺皿就可以了,我其中一个是这样做的,长得克隆较大,很好挑选。
下面简要的说一下对照的结果。
A 只长出了3个克隆,以100的基数计算,约为3%。即双酶切反应中质粒只有3%进行了单酶切
B 约有5个克隆,即质粒完全没被切动的约5%
C 长了很多克隆,证明操作系统没有问题。为系统控制指标。
D 长了很多克隆,证明感受态没有问题。
这些对照相辅相成,扬长避短。万一什么都没作出来,也好分析原因。
JM108感受态细胞的制备
刚开始做实验时,是向TAKARA购买的,一支30元,定了10支。后来干脆自己做,感觉质量和TAKARA的质量不相上下,下面谈谈我制作感受态的体会。
前期工作
分子生物耗费时间在于准备过程太多。所以做好前期工作非常重要,所谓‘磨刀不误砍材功’。
注意事项
1.不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种划板(AMP阴性)37度过夜培养,划板时用小TIP头挑少许冰渣即可,轻划S行。同时记得设立对照:A 、在AMP阳性板划菌,排出AMP抗性菌污染。大家都知道,实验室很多材料从师姐传师妹,或许经过很多人的转手。所以从头鉴定所用材料的可靠性非常必要。B、AMP阴性空白培基。系统控制参照,为更准确起见,用TIP头不沾任何东西进行划板。第二天挑克隆。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。 不过我一般链接反应后(TAKARA的链接酶,体系25微升)会全量加到200微升的感受态里,约为150ng(载体0.1微克,目的片段约0.05微克)。效果也好。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。国产的当然也可以。我用都是国产的,好像是陇西化学制剂,分析纯。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
培养基的配制
1.配制LB-AMP抗性培养基LB液体培养基:精解蛋白胨10g,酵母抽提物5g, 氯化钠l0g,加去离子水800ml充分搅拌溶解,用1mol/LNaOH调pH7.0,补加去离子水至1000毫升,高压灭菌,4度保存。我一般没有用1mol/LNaOH调pH7.0。而是直接精解蛋白胨10g,酵母抽提物5g, 氯化钠l0g加去离子水至1000ml。
2.LB固体培养基:LB液体培养基中加1.5%琼脂粉,高压灭菌消毒;
3.Amp母液:用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml即100 ug/ul溶液,置-20℃保存;AMP500mg/支,一支用5ml稀释即得。然后分5支分装(浓度100mg/ml即100 ug/ul)。
4.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB液体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为100ug/ml摇匀后铺板(30ml/90mm):即多少毫升培养基加多少微升上述的Amp母液多少毫升培基=加多少微升母液,或减半量则最终浓度为50ug/ml
有指南上写细菌转化后37度复苏时用SOC培基。我从来只用AMP阴性的普通培基,效果也很好。
5.0.05mol/L CaCl2溶液:我们实验室只有CaCl2-6H2O,分子量219,配制100ml的,则需称量0.005×219=1.095g就可以了。其实氯化钙的摩尔浓度在0.05-0.1mol/L均可。溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 先配制成0.1mol/L的氯化钙溶液50ml,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。有文献说要用0.22的滤器,其实完全没有必要。高压即可。
准备工作做好了,就可以开工了。