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6. 血清之沈淀物
6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。
6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37 oC 中欲培养此“微生物“，但在37 oC 环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。
7. 血清之生长测试
7.1. 材料：
7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )
7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish)
7.1.4. methanol
7.1.5. glacial acetic acid
7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)
7.2. 步骤：
7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS (已测试过) 培养MDCK 细胞于T75 flask 至80% confluency。
7.2.2. 以trypsin-EDTA 处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM 制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM 稀释细胞浓度为1×102 活细胞数/ ml。
7.2.3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同浓度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血清最终浓度为10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组试验。
7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培养箱培养5-7 天，期间不需更换培养基，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。
7.2.5. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静置10 min。
7.2.6. 去除固定液，水洗二次。
7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。
7.2.8. 去除染液，水洗二次。
7.2.9. 以肉眼计数群落数
7.2.10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency )：
SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %
7.2.11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency)：
SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %
7.3. 比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长的影响。
7.4. 订购多量同一批号的优良血清，置于–70 oC 保存之

冷冻细胞活化
1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3. 材料
3.1 37 oC 恒温水槽
3.2 新鲜培养基
3.3 无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶
3.4 液氮或干冰容器
4. 步骤：
4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
4.3 将新鲜培养基置于37 °C 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
4.4 取出冷冻管，立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
4.5 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。
4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内，离心1,000 rpm, 5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。
4.7 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。




细胞传代培养
1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞
种类而异。
2. 材料：
2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS,
GibcoBRL 21600-010)
2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)：
以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20 oC，使用前放在37 oC 水槽
回温。
2.3. 新鲜培养基
2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶
3. 步骤：
3.1. 附着型胞(adherent cell)
3.1.1. 吸掉旧培养液。
3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。
3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 oC 作用数分钟，于倒
立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA 溶
液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA 作用后，加入适量含血清
之新鲜培养基终止trypsin 作用，离心后再吸掉上清液。)
3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数
次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常
培养条件培养。
3.2. 悬浮型细胞(suspension cell)
3.2.1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。
3.2.2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的
培养瓶中，以正常培养条件培养。
3.3. 融合瘤(hybridoma)
3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可
能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基
稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。




细胞计数与存活测试
1. 原理：
1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。
1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形，
其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方
盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计
数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞
数目。
1.3. 存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细
胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细
胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。
2. 材料：
2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.2. Erythosin bluish stain
取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl
paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline
2.3. 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip)
2.4. 计数器(counter)
2.5. 低倍倒立显微镜
2.6. 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics)
3. 步骤：
3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于
1.5ml 小离心管中。
3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于
100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin
bluish)。
3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue
等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线
上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml
*每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml
3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细
胞。
3.5. 范例：
T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan
blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之
细胞数目。
活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59
死细胞数/方格：5, 3, 4, 6
细胞总数= 243
平均细胞数/方格= 60.75
稀释倍数= 2
细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
细胞数/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率：225/243﹦92.6 %

细胞冷冻保存
1. 注意事项：
1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 – 90 ％
致密度。
1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二
日测试是否有抗体之产生。
1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron
FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积
分装，4 oC 避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽
灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
1.4. 冷冻保存之细胞浓度：
1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻
浓度太高而在解冻24 小时后死去。
1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须
较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106
cells/ml。
1.5. 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保
存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
1.6. 冷冻方法：
1.6.1. 传统方法: 4 oC 10 分钟---> -20 oC 30 分钟---> -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜)
---> 液氮槽vapor phase 长期储存。
1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以–1 ～ -3 oC/分钟之速度由室温降至–120 oC，
放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。
2. 材料：
2.1. 生长良好之培养细胞
2.2. 新鲜培养基
2.3. DMSO (Sigma D-2650)
2.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)
2.5. 0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.6. 血球计数盘与盖玻片
2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II)
3. 步骤：
3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10
％，混合均匀，置于室温下待用。
3.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细
胞浓度及冻前存活率。
3.4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混
合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污
染检测。
3.5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 10 分钟→ -20 oC 30 分钟→ -80 oC 16～18 小
时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。
3.6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序
为: program 7: HB CELL




收到细胞的处理方式
细胞活化︰
1. 收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。细胞
株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于–70 °C， 隔夜后， 移到liq N2)。
2. 冷冻细胞解冻程序:
2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比
例， 制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之
血清种类， 若因实验需要， 必须有所不同时， 务必以缓慢比例渐次改变培养
基组成， 确定细胞适应后， 方进行所需之实验。
2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse
serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种
类培养之。
2.3. 将培养基置于37 °C 水槽中回温， 回温后喷以70 % 酒精并擦拭之， 移入无
菌操作台内。取出冷冻管， 立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 水面高度不可
接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全
部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部， 移入无菌操作台内。
2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask
中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基， 混
合均匀，放入37 °C，5 % CO2 培养箱培养。
2.5. 对绝大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活
化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除， 待第二天确定细胞生长或贴附良
好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需
立即去除DMSO 者， 则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中，
离心300 xg (约1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，
将细胞均匀混合后， 转移至培养瓶中， 再放入37 °C， 5 % CO2 培养箱培养。
收到T25 flask 细胞时， 处理方式为︰
1. 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。请检查
flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题， 不
要打开盖子，请立即通知细胞实验室。
2. 将原封之T25 flask 静置于37 °C， 5 % CO2 培养箱中，使细胞回温至37 °C， 并
让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出flask
内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依
一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养。

学习了，无菌操作要从环境、设备、物品、器具、人员、操作方面去控制！

原文由 一道黑(qingwenh) 发表:
学习了，无菌操作要从环境、设备、物品、器具、人员、操作方面去控制！

无菌要做好这个工作

之前培养过一段时期的细胞，无菌操作还是很难的

主要还是操作啊