主题：【原创】提问帖（5.17）：提高液相色谱中柱效的最有效途径有哪些?（答案已出）

通过逐渐改变分析条件，在保证物质分离度的前提下，让难流出的物质加速流出，以提高分析效率的方法；不同点，程序升温只能从低柱温逐步升高，只能改变升温的速率，而梯度洗脱可以使用多种溶剂，采用复杂的比例变化来达到满意的分离效果，更灵活 4，应该是：减小填料粒径,增加色谱柱长，使用尽量大小均一、外型规则的填料，使用合适的流速，使用合适的流动相组成，使用合适的固定相。1，不能依靠理论塔板数来判断分离的可能，理论塔板数描述的是液相色谱柱柱效，塔板数越高，说明色谱柱的分离性能越好(一个宽泛的概念)，但具体到某些物质能否互相分离，应该用分离度来描述，两个物质的分离度大于1.5，说明能互相分离，否则就不能，这个跟理论塔板数毫无关系

1、提高液相色谱柱柱效的方法
　　
　　我们知道色谱峰的扩宽与移动相在热力学的分配过程、移动相和固定相中传质阻力
　　
　　所引起的不平衡有关,谱峰扩宽（非平衡）的程度是流速对传质速率的直接函数。要提
　　
　　高液相色谱的效率可从以下几方面入手。
　　
　　（1）降低移动相的流速,但会使分析时间延长。
　　
　　（2）减少固定相的量,但色谱柱中样品的负载量也随之减小。
　　
　　（3）减小固定相的颗粒度,但不能过分,过分后色谱柱的渗透率也会减小。
　　
　　（4）选用低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。
　　
　　（5）适当提高柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。
　　
　　（6）尽量减小停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。
　　
　　从以上介绍可看出,在色谱分析过程中,各种因素是互相联系和制约的。只有通过对
　　
　　柱效值的跟踪测算,对自己分析方法不断的研究和实践,才能找到最佳的工作条件。
　　
　　2、对柱效值进行跟踪测算应注意的问题
　　
　　我们也应记住柱效值即塔板数只表示该色谱柱装填的好坏,只用柱效值并不足以预测
　　
　　在所有条件下的柱性能,因为在这些条件下,柱性能主要表示动力学过程对色谱柱谱
　　
　　带加宽的量。其他一些影响峰宽的因素,如柱外效应和热力学因素（通常表现为峰拖
　　
　　尾）,在理想情况下对于确定柱效值并不起重要作用。因为任何一个柱性能的定义都
　　
　　必然与用此色谱柱所做的分离相联系,所以依据一个单独的数字来评定柱性能是不切
　　
　　实际的。对大多数色谱工作者来说,柱性能指的是色谱柱用于特定分离的能力,而仅
　　
　　仅有高柱效并不能保证这种分离能力。
　　
　　不管用什么特定的测试方法,都会有几个参数影响柱效的测定。这些参数包括:洗脱
　　
　　液的成分和粘度及其线流速,测定塔板数所用的溶质,温度,柱长,填料装填方式,颗粒
　　
　　度,还有所选用的测量和计算方法。尽管大多数柱效测算没有设法消除液相色谱仪器
　　
　　系统各部件对表观峰宽的影响,但只要仪器是正常使用的,这些影响是次要的。而测
　　
　　量和计算方法对柱效值的确定起着极大的作用。
　　
　　3、几种测量和计算柱效值的方法
　　
　　因为色谱峰是假定样品浓度在移动相和固定相中呈正态分布而得到的样品谱带分布,
　　
　　故常常把色谱峰型看作正态曲线来计算理论塔板数。因此计算柱效（以理论塔板数n
　　
　　为单位）的公式习惯上定义为:
　　
　　式中tR为色谱峰的保留时间;σ2是以时间为单位测量色谱峰的偏差;a是和峰高（从
　　
　　测峰宽的基线量起）有关的常数,ωb是峰宽,表示由色谱峰顶点与色谱峰两侧拐点处
　　
　　做切线与峰底基线相交两点间的距离。　　
　　4、结论
　　
　　假如一个色谱峰真是正态峰型,那么每种计算方法都会得到同样的结果。然而即使一
　　
　　些比较理想的仪器和倾向于得到对称峰型的溶质,由于柱内的槽或空隙,也会出现非
　　
　　正态峰型。所以不同的计算方法将会得到相差较大的n值。通常偏离正态模型的峰型
　　
　　表示为“前延”或“拖尾”。对于这些峰型,越在峰的高处测量,计算的理论塔板数
　　
　　值就越大（准确性越低）。在许多情况下,色谱工作者需要能反映整个峰型（包括拖尾）
　　
　　的柱效值,同时为了保证定量的重复性,也需要色谱峰很好的对称性。这时对色谱峰
　　
　　非对称性最敏感的计算方法最适合。如果目的
　　
　　仅仅是要监测色谱柱从第一次使用到使用寿命结束这一过程中的柱效,那么以上任何
　　
　　一种方法都可以,应选择最简便的方法。

液相色谱中提高柱效的途径主要有:1.提高柱内填料装填的均匀性;2.改进固定相,减小粒度; 选择薄壳形担体; 选用低粘度的流动相; 适当提高柱温。其中,减小粒度是最有效的途径

色谱柱是消耗品，理论来说，柱效很低的色谱柱是没得救的，但是有一招，也就是当你发现色谱柱没得救的时候可以用一下，就是反冲色谱柱，但是你要注意的是，流速不要设置太大，这样的话还能再坚持一会。如果这样也没用的话，你就重新买吧。

柱效受外界影响的因素主要有以下2点：温度、流动相相关内容（成分、PH），对这2方面做一下调整看看效果如何，如果不行，可以尝试把柱子按流动相走向反接进行试验（不推荐，但是有时候效果很好，如果这根柱子做所有品种都有柱效低的情况，可以采用这个办法）。


色谱柱柱效过低，就必须要对柱子进行再生了，一般再生有两种办法，第一种办法要拆开柱头重新补充固定相，但这种办法不但麻烦，而且有时操作不当会使柱子报废。所以一般先采用第二种办法法，就是冲洗再生。
1 反相色谱柱的清洗和再生
反相色谱法是当今液相色谱法中应用最广泛的一种技术，它能分析非极性、可离子化和离子化样
品，应用比例超过90％．随着HPLC技术的发展，色谱柱的种类也越来越多，除经典的键合硅胶固定相填充柱，还有如聚合物填充柱、聚合物整体柱及以氧化锆基质固定相为代表的其它无机基质固定相色谱柱．这些色谱柱因其固定相基质差异，具有不同的物理和化学性质及应用范围，其清洗与再生方式也存在一定差别．
1．1 硅胶基质反相色谱柱的清洗与再生
在反相色谱中，硅胶基质色谱柱使用比例达70％ ，被应用于各种样品的分析．清洗硅胶基质反相
色谱柱，关键是弄清楚污染物的性质，并且能找到合适的溶剂将其洗脱．对于被不同样品污染的色谱柱，如常规样品污染、蛋白质污染及金属离子污染的色谱柱，具有对应的清洗和再生方法．
1．1．1 常规样品污染色谱柱清洗与再生方法被常规样品污染的硅胶基质反相色谱柱，已有各种清洗与再生方法．其中最常用的是用20倍柱体积(这里柱体积指色谱柱内空腔体积，表1列出了
常用规格分析柱柱体积 )的乙腈一二氯甲烷一正己烷一二氯甲烷一乙腈冲洗色谱柱 ，或者用强度
更弱的溶剂系统清洗，即：水一乙腈一氯仿(或异丙醇)一乙腈一水冲洗，其中水冲洗步骤可以省略。艾杰尔公司使用乙腈：水(5：95，WV)一四氢呋哺一乙腈：水(5：95， )冲洗10倍柱体积，此方法达到较为理想的结果，同时能大大节省时间．强酸和强碱溶液会导致硅胶基质填料溶解，但是在某些条件下使用稀酸可以将有机溶剂不能洗脱的污染物去除，如用甲醇一氯仿一甲醇冲洗20倍柱体积达不到清洗效果，可依次用20倍柱体积水、0．05 mol／L的硫酸和流动相溶液冲洗色谱柱，可取得良好效果．经过多次进样的色谱柱，用90％ ～100％ 的溶剂B(强洗脱溶剂)冲洗2O倍体积即可清除污染物l_ J．当强洗脱溶剂无法洗脱时，则有必要用更强的一种或一系列溶剂清洗，即：100％ 甲醇~-qO0％ 乙腈一乙腈： 异丙醇(75：25，V／V)一100％ 异丙醇一100％ 二
氯甲烷或100％正己烷．根据色谱柱具体使用情况，在清洗过程中可省略一个或多个有机溶剂除了以上这些方法之外，还有一些使用更强溶剂、耗费时间较短的方法．依利特公司月j 20倍柱体积的二氯甲烷： 甲醇(96：4，V／V)，加1％氢氧化铵冲洗，其中加入的氢氧化铵对聚集在柱头的污染物具有良好的清洗效果．二氯甲砜也被Themo公司用于色谱柱的清洗，具体方法是：在用水冲洗色谱柱同时进4等份的200 L二氯甲砜，然后依次用甲醇、氯仿和甲醇冲洗．用N，N一二甲基甲酰胺、丙酮依次冲洗色谱柱，可将色谱柱柱效提高约50％ to]．这些方法耗时短，但使用的特殊溶剂，如氢氧化铵、二氯甲砜、N，N一二甲基甲酰胺等，均对色谱固定相有一定损伤．
当色谱柱被严重污染，可在低于0．5 mL／min的流速下用二甲基亚砜(DMSO)或50％二甲基甲酰胺一水冲洗色谱柱 ．实验证明在线清洗与再生的方法对非严重污染色谱柱非常有效，对污染特别严重的色谱柱不能达到理想效果，需将固定相从色谱柱内取出，进行清洗再生后重新装填．具体操作是：将色谱固定相从色谱柱内打出后，用甲醇浮选，去除其中细小的破碎颗粒；然后用二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇超声清洗；最后70 c【=水浴蒸干固定相，重新装填色谱柱．经该方法处理的色谱柱，性能可得到显著提高 ·
由上述方法可以看出，一般清洗方法所用的溶剂系统，溶剂洗脱强度均逐渐增加，使用强疏水性溶剂(如氯仿和正己烷)溶解非极性物质如类脂和油类，这类物质往往是色谱柱污染的最主要原因．正如正相与反相系统替换时，必须使用过渡溶剂冲洗系统，在色谱柱清洗与再生过程中，也必须保证一系列溶剂中每种溶剂都均与下一个溶剂互混．异丙醇能与正己烷或二氯甲烷互溶，又与水相溶剂互溶，常在清洗过程中用作过渡溶剂．但是异丙醇粘度非常大，需使用较低的流速以免导致泵压过高．而使用过渡剂，清洗步骤繁琐，正如Majors所说：这是一个繁杂而又非常耗时的过程 j．此时利用梯度系统进行过夜操作是最好的选择，但梯度操作的系统要求更高，对一个复杂的清洗方法往往需要四元甚至五元梯度系统．
2 正相色谱柱的清洗与再生
通常正相色谱柱的清洗与再生方法与反相色谱柱用极性逐渐减弱的溶剂系统冲洗相反，其用极性
逐渐增强的溶剂系统冲洗¨ ．根据Themo公司研究，硅胶、氧化铝、极性键合相色谱柱按以下方法冲洗：3一甲基戊烷或己烷一三氯乙烷一乙酸乙脂一丙酮一乙醇一水，然后以这些溶剂逆序冲洗，最后以流动相平衡．该方法从非极性溶剂缓慢过渡至极性溶剂水，然后逆序冲洗至非极性溶剂，对色谱柱损伤小，且具有良好的再生效果．然而该方法耗时长，消耗溶剂多，在很多时候应用较少，因此在具体应用过程中可省略其中一种或几种溶剂．Agilent公司使用的方法更简洁，用甲醇：氯仿(50：50， )一乙酸乙酯反冲色谱柱，然后再按正方向用流动相平衡．常规硅胶或硅胶基质正相色谱柱，也可依次以四氢呋喃、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷和无苯正己烷冲洗40～ 60倍柱体积¨ ，或用5％ ～95％ 乙腈水溶液的60min梯度清洗，然后用30 mL含2．5％二甲氧基丙烷和2．5％ 冰醋酸的正己烷溶液冲洗色谱柱，除去硅胶上吸附的水(艾杰尔公司)．对强惰性的石墨化碳和有机聚合物正相柱，可以使用一些强酸或强碱清洗．Shodex及Themo公司用的稀酸和稀碱结合清洗法，可将有机聚合物正相柱上大部分污染物洗脱：5 mL水一60 mL的0．1tool／L HC10 水溶液一5 mL水— 0 mL的0．1 mol／LNaOH水溶液一5 mL H，O在0．5 mL／min流速下反向冲洗．使用0．1 mol／L盐酸与有机溶剂结合清洗石墨化碳柱，也具有良好的再生效果：二氯甲烷、甲醇、水、0．1 mol／L盐酸、水、甲醇、二氯甲烷，最后用0流动相冲冼至平衡．
对于是不同的色谱柱冲洗方法都不一样，所以在再生操作前，一定要查到相关的专著再进行。

柱效指的是色谱的分离效果，其不仅与柱长有一定的关系，主要与色谱柱的填充物有关

一般长度越高，柱效就越高。但柱效与柱子所用材料等很多因素有关。

柱长L,柱效n(塔板数) 
关系L1/L2=n1/n2

终于又有人来参与答题了

以提高分析效率的方法；程序升温只能从低柱温逐步升高，只能改变升温的速率，而梯度洗脱可以使用多种溶剂，采用复杂的比例变化来达到满意的分离效果，更灵活 .减小填料粒径,增加色谱柱长，使用尽量大小均一、外型规则的填料，使用合适的流速，使用合适的流动相组成，使用合适的固定相。

一、提高液相色谱柱柱效的方法
我们知道色谱峰的扩宽与移动相在热力学的分配过程、移动相和固定相中传质阻力所引起的不平衡有关,谱峰扩宽(非平衡)的程度是流速对传质速率的直接函数。要提高液相色谱的效率可从以下几方面入手。
(1)降低移动相的流速,但会使分析时间延长。
(2)减少固定相的量,但色谱柱中样品的负载量也随之减小。
(3)减小固定相的颗粒度,但不能过分,过分后色谱柱的渗透率也会减小。
(4)选用低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。
(5)适当提高柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。
(6)尽量减小停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。
从以上介绍可看出,在色谱分析过程中,各种因素是互相联系和制约的。只有通过对柱效值的跟踪测算,对自己分析方法不断的研究和实践,才能找到最佳的工作条件。

拐点法(Inflectionmethod):在拐点处峰宽等于标准偏差的2倍,该法对不对称色谱峰最不敏感。
半峰宽法(Widthathalfpeak):该法最常用,计算者的主观误差降到最小,有很好的重复性。
切线法(Tangentmethod):由于切线是人为确定的,色谱峰的对称性对该法的偏差起决定作用。
3σ,4σ和5σ法:这些方法对色谱峰非对称性的灵敏度随上述顺序增加,测量位置越接近于峰底,其结果受拖尾或前延的影响越大。5σ法对于确定基线的准确性也很灵敏。
峰高/峰面积法(Height/areamethod):该法可通过积分仪或计算机直接计算出n值。n=2π(htR)2/A2,h为峰高,A为峰面积。
量矩法(Momentmethod):此法避免了假设特定的峰型,如果有合适的,正确的程序计算设备,它能够最精确地表示理论塔板数。
非对称法(Asymmetry-basedmethod):从峰顶向基线画一垂线,在峰高10%处测得垂线两边峰宽A,B的长度,并计算其比率。由于便于测量,该法最能反映色谱峰的非对称性。
在新的国家液相色谱仪检定规程中,也增加了对色谱柱柱性能的测试,采用的方法是半峰宽法和非对称法。