主题：【原创】提问帖（5.22）：在平时的检测过程中，为了让色谱柱不被堵塞或污染，大家一般都会采取什么措施？（答案已出）

色谱柱缓冲盐洗出及柱头污染的解决办法

　　色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），以下列举了部分常见原因及解决办法：

　　1）色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；

　　可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。

　　2）色谱柱头的填料被样品污染；

　　如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。

　　3）色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；解决方法：如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。

色谱柱出现问题的解决办法
色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高(系统管路堵塞及压力传感器故障除外)，以下列举了部分常见原因及解决办法：
1.色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；
解决方法：如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。
2.色谱柱头的填料被样品污染；
解决方法：如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。
3.色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出； 解决方法：如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。
4.流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决方法：如果因pH值使用不当，很难恢复

液相色谱柱的维护
1、 注意正确地使用和存放色谱柱，不锈钢柱色谱柱可选用以下的溶剂保存：正相柱用烃类溶剂，反相柱用甲醇，离子交换柱用水或甲醇/水。某些专用分析色谱柱要注意制造商规定的保存条件。另外，要注意溶液的PH值，一般控制在PH2－8范围内，其硅胶柱PH＞8时会发生硅胶溶脱的情况，键合型柱PH＜2时会发生键合相断裂。
2、 色谱柱污染后可采用合适的溶剂冲洗，使柱效再生。
⑴硅胶柱可以使用正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和水按顺序冲洗色谱柱，经过净化的色谱柱必须进行水活化，即按上述相反的顺序冲洗。柱再生时所需要的有机溶剂要严格进行脱水处理。
⑵反相柱可以用甲醇、氯仿、正庚烷冲洗，键合C18柱一般用甲醇冲洗，必要时可用0.5 M EDTA钠盐溶液冲洗，然后用水冲洗，以达到去除柱内盐类。
⑶键合型的离子交换柱可以用缓冲溶液、水、甲醇冲洗。
3、 对污染严重的色谱柱在冲洗无效时，需将柱内填料取出进行处理或换新的填料，还可以用更换柱头填料的方法即将柱头入口处的被污染的填料取出，重新补装和柱内同类型的填料，然后在改变柱流向进行再生。种逆流再生柱的方法，可以救活大部分柱子。
4、 注入色谱柱的溶剂、标液、样品溶液都必须严格过滤，以去除杂质，防止堵塞色谱柱。当用反冲洗方法无效时，可将柱口过滤装置取下，用弱酸溶液处理，去除污物或定期更换。
5、 建议：为了保护色谱柱，避免给分析带来不必要的麻烦，请使用保护柱！！仅作参考。

1、色谱柱的使用说明：
（1）、色谱柱使用前注意事项：
色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。
（2）、流动相：
流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。
以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0，BDS C18适合于碱性化合物，PH值适用范围为2.0-10.0。当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。
（3）、样品：
样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。

2、色谱柱的保存

（1）、反相色谱柱每天实验后的保养：
使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。
（2）、长期保存色谱柱：
如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。

3、色谱柱的再生

因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。
（1）、反相柱的再生：依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。
（2）、正相柱的再生：依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。

4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法

色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），可能的原因有如下几点：
（1）、色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；
（2）、色谱柱头的填料被样品污染；
（3）、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；
（4）、流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。
解决办法如下：
（1）、如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。
（2）、如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。
（3）、如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。
（4）、如果因PH值使用不当，很难恢复。

色谱常见问题回答
问：用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决?
答：关于漂移问题：
1温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定
2流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等
3柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡
关于快速变化问题
1流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定
2泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。
3流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合
问：色质联用中毛细柱的选择应注意什么问题?
答：1柱效要高
2热稳定性好
3化学惰性强
具体选择应注意
1柱极性。根据分析样品选择不同极性的柱子进行分析
2柱子内径。内径大小决定柱容量
3液膜厚度。分析样品温度一不一样，对膜厚有不同要求，温度高液膜要厚，温度低液膜要薄
4柱长度。柱越长，柱效越高，分离效果越好，但也存在吸附问题，柱子过长，分析时间长，因此要根据样品考虑柱子长度
5外涂层(柱体)的选择
6另外还有仪器型号、分析对象等因素
问：液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?
答：1筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
2存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子
问：从那些方面可以简单判别毛细管柱子的热稳定性好坏?
答：1分配容量(或容量因子)K，好的柱子在高温运行后，分配容量K不应有明显的下降，否则，说明柱子的热稳定性不好。
2理论塔板数n，热稳定性好的柱子经受高温后，理论塔板数应基本保持恒定
3柱子的极性。热稳定性好的柱子，高温前后极性变化不大，具体表现为保留指数I值没有大的变化。
4噪声。热稳定性好的柱子在高温下使用后，噪声不能增加.
5柱子的去活层，毛细管柱子涂固定液前内部一般要用去活性试剂去活以增加惰性。质量好的毛细管柱子高温后，去活层不应该变化，表现在对强极性样品或酸碱性样品的吸附性不能增加。
问：为什么进样器内的玻璃衬套会对色谱行为造成影响?
答：进样器内的玻璃衬套主要有下列作用：
1提供一个温度均匀的汽化室，防止局部过热。
2玻璃的惰性不如不锈钢好，减少了在汽化期间样品分解的可能性。
3易于拆换清洗 ，以保持清洁的汽化室表面，一些痕量非挥发性组分会逐渐积累残存于汽化室，高温下会慢慢分解，使基流增加，噪声增大，通过清洗玻璃衬套可以消除这种影响。
4可根据需要选择管壁厚度及内径适宜的玻璃衬套，以改变汽化室的体积，而不用更换整个进样加热块。从以上几个方面可以知道玻璃衬套对色谱行为造成影响的原因。
问：毛细管色谱分流进样时，非线性分流的主要原因是什么?
答：1进样器温度太低，样品汽化不完全，发生分级分流。
2进样器温度太高，某些组分可能发生热分解，也有的样品可能发生催化分解，或样品部分地被吸附在进样器内表面上。
3在分流点以前样品没有混合均匀或混合不充分。
4系统的进样垫，柱接头等地方漏气。
问：HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法
答：1样品量不足：解决办法为增加样品量
2样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器
4检测器衰减太多：调整衰减即可。
5检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数
6检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。
7检测池中有气泡：解决办法为排气。
8记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。
9流动相流量不合适：调整流速即可。
10检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
问：做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决?
答：原因可能有：
1泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；
2比例阀失效，更换比例阀即可。
3泵密封垫损坏，更换密封垫即可。
4溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；
5系统检漏，找出漏点，密封即可。
6梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
问：做PGS／MS分析时，如何防止焦油状污染物进入毛细柱?
答：聚合物，尤其是一些含氮、硫及卤素的高分子裂解时，常有焦油状物质产生。为防止这种焦油状物质进入毛细柱造成污染而使柱性能下降，可采用保护预柱，即在裂解器与毛细柱之间接一填充预柱，通过控制预柱温度而使焦油状物质滞留在预柱内，预注可置于GC气化室内，这样既容易控制温度，又减少系统的死体积，当然，预柱填料需经常更换。
问：我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么?
答：这是因为被分析物可能具有形成氢健的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺(TEA)，将会使硅醇基的成键能力饱和，从而保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。
问：我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么?
答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
1拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；2把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。
3将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，(此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动性)。这时，如果柱压仍不下降，再检查；     
4更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
问：高温毛细柱的使用寿命一般为多长?
答：毛细柱寿命除决定于柱子本身的性能外，在很大程度上取决于使用情况，比如使用温度、样品状态，进样量等，如果在其使用温度范围内，样品干净，色谱柱不被污染的情况下，柱子寿命一般在2—3年之间。
问：如毛细管柱被污染，柱效和分辨率降低，有何方法使它恢复?是否可通过老化来解决?
答：根据柱污染程度可采取不同的方法来解决，如果污染不严重，污染物沸点不是太高，可通过老化来解决，但老化温度不可超过柱子的最高使用温度，且一般要较长时间(8—30小时)，如果污染较严重，或通过老化仍不能使柱性能恢复，那就必须采用溶剂清洗，通常是用5倍柱容积的溶剂(如正戊烷，二氯甲烷等)通过色谱柱。当然，清洗溶剂用的越多，对柱性能的损坏越大，清洗完后，在通载气老化一定时间，如果柱性能恢复，便可继续使用。必须指出：只有交联柱才能清洗，对于非交联柱，清洗柱会彻底失效，因为固定液被洗掉了，至于清洗用溶剂的选择，可参考说明书。
问：BPX70毛细管柱是否可用于GC／MS分析?
答：完全可以，BPX70为极性柱，使用温度范围宽(25—260℃)，程序升温可达290℃，流失低，适合于分析脂肪酸甲酯的各种位置和几何异构体，药物异构体，碳水化合物等。因BPX70为交联住，故用于GC／MS很稳定，污染后可清洗再生。

高效液相色谱检测和维护大全（本人总结）
    至于今，我进行高效液相色谱检测分析进行了近2年，在近2年的色谱仪器分析工作中，我积累了大量的色谱仪器操作和维护的经验，对本人和后来的仪器操作工作者，可以说有一定的启示和借鉴作用，所以，我是毫无保留的奉献出我的这部分经验，以感谢光临我博客的朋友！
  一、色谱分析的准备工作：
    在药物分析部门的工作中，对于液相色谱分析工作者而言，进行的药物分析的药物种类或品种时很多的，所以，我们在进行分析工作前，我们要对自己所要进行的药物品种和色谱柱进行统计，尽量做到专药专柱、专柱专用。这样，我们在进行药物分析和检测工作时，又不会造成色谱柱的交叉污染。
在做到药物分析用的色谱柱专药专柱用之后，可以明确知道该柱的流动相中缓冲液与有机溶剂的配比，快速进行流动相的配制（因为不同厂家和不同型号的色谱柱，即使分离分析同一品种的药物，其流动相的配比都是不尽相同的）。对于以后流动相的配比能做到有的放矢，也就是说，相对药物的保留时间和流动相的流速也就相对固定了下来。所以，在之后的相同药物的分析可就能顺手拿来做好了，不存在在以后的试验中还去摸索不同柱子的流动相的配比了。在以往的试验中，最常出现的情况时，没有做到专柱专用，今天做这药物药调节流动相配比，明天又换根柱子，又是调节流动相配比一番，耗时又缺乏对这种药物分析时的保留时间的不可重现性。让非专业人员看了觉得不可理解。同时，对试验者本人来说，也可具有不同时间的试验比较，具有后续试验的参考意义。
    二、分析前，对色谱柱的预处理和平衡过程重视。在每天的实验前，一近实验室，就立即要安排好今天该做的分析工作，连接好今天药物分析所用的专柱，打开色谱泵，用流动相中的相应有机溶剂的含10%有机溶剂的水溶液进行排气和冲洗色谱柱和管路，冲水30分钟左右，将色谱柱中的纯有机溶剂替换掉，然后再用流动相进行足够时间的平衡，大约1小时左右。此时，一般来说，色谱柱应该说是够平衡了。注意在色谱柱平衡半个小时时，打开检测器，在平衡近1小时时，打开色谱工作站，点击查看基线，看基线是否走平直。在基线走平直后，方可进行分析检测，才能保证检测结果的准确性和保留时间的重复性。
    三、分析前的流动相脱气、色谱管路及泵内排气和每天必须要做的事情，否则，在实验过程中，就会造成（1）泵的流速不稳、有时候流速甚至相差甚远，（2）泵压来回波动很大，（3）检测器采集的图像基线很难稳定和走直，出现基线漂移和波动。（4）色谱峰面积不重现，最麻烦的是好好的色谱峰上突然出项和汽泡锯齿，影响峰面积的读取。
    四、色谱分析过程中，一般是采用定量环进行手动进样或者是采用自动进样器进行进样，一般来说，能保证较好的进样量的重现性。所以在进行进样检测时，关键的步骤时溶液的配制，要做到对照品和待测样品的充分溶解，同时也要充分摇匀，使溶液均有均一性。六通阀进样器，若采用手动方式，应注意的是：你进样时，是将其从load位置扳到inject的位置，有的人是采取进样后一分钟左右又将其反扳回至load位置，这种习惯是很好的，因为在load位置，管路不通过定量环，可以减少定量环的承压时间，保护定量环。但是要注意，你在这分析过程中，你始终要保持相同的处理方式，以保证测量结果的重现性。
    在我们的试验分析中，我们采用称量样品和对照品的是：采用干燥洁净的2mL的小烧杯进行称量，然后小烧杯连同药品一起放在普通漏斗中，将漏斗插入容量瓶，加水或流动相进行溶解，冲洗漏斗和容量瓶，取下漏斗，加水或流动相至刻度，充分摇匀，进行进样分析。我认为这种称样和溶样方式比用称量纸称量和容样方便和准确。毕竟称量纸或多或少的具有吸湿性的，影响称量的准确性。因为在进行液相色谱分析中，药保证分析结果的准确性，称样和容样也是分析结果准确性的关键的一步。
    五、在样品的采集和数据或图像结果分析的过程中，要注意的是：因为色谱工作站的处理方式和能力是有限的，因为它只是人脑的机械反应结果。在色谱工作站的设置上，色谱工作站的积分设置方式都设置有两种：一种是自动积分；一种是手动积分。这两种积分方式各有其有点，但各也有其不足之处。对于仪器的自动积分方式，虽然是计分方式是方便，但是你自己去仔细观察，有时候它的积分位置很不准，所以相对来说，它所积分的峰面积结果自然是不准确的了，你若采用这种积分不准确的峰面积结果去进行计算，自然是不准确的。有时候你会发现，你对某一药物的平行含量分析时，发现两个平行样的结果不平行，有时候不是你的操作引起的，是色谱工作站自动积分不准确的原因。另一种是手动积分方式，很多人是很提倡这种积分处理方式的，但是这里就存在有对图形和数据的认知的熟练程度，不同的人操作时的结果是有很大出入的。也就是说这种积分方式的难度就是：随意性大、难以掌控。我发现很多人甚至是一些制药厂和药检所的人员都还是一味地崇尚于和推崇手动积分方式。我个人认为：真正的最佳积分方式是应该将二者有效的结合起来，我以前是推崇手动积分的，但是对于大多数初次使用色谱仪器的使用者和分析检测人员，确实存在一个很难控制的“度”，所以很难做到准确定量结果。而采用两种积分方式的有效结合，可以很好的掌握这个积分结果的“度”，定量结果也就准确了。具体的做法是：在色谱工作站上找到仪器参数设置中的积分，将其中的“斜率设置”数值改些，例如，N2000色谱工作站，你就可以将其斜率值设置为合适大小的数值，我一般设置为“4250”左右，它的系统默认值为“70”；SrAdv30色谱工作站，我一般设置为“1250”左右，它的系统默认值为“30”，峰面积的积分结果重现性很好，并且这种通过改动“斜率”的积分方式也是自动的，减少了分析检测人员的手动积分随意性和不确定性，改善了结果的准确性和重现性。对于某些采用过改动“斜率”的积分方式来积分的积分位置，你认为还不太适当，这时候，你就可以通过少许的手动积分方式处理来进行处理，这时候你的手动积分方式你就拿的准了，因为斜率积分方式已经为你提供了一个手动积分的“度”了。这个两种积分方式的有效结合使用，是我个人在色谱图想和色谱数据处理上的经验积累，特奉献给同行者，以供参考。
  六、在处理色谱数据和试验结果时，学会充分利用计算机软件。我推崇使用excel计算软件。将你实验所得的峰面积、样品质量、对照品质量、对照品峰面积、对照品含量输入excel表格，利用excel的函数功能，建立函数表达式，对于每一个实验，你只要输入相应的样品质量和相应峰面积，结果软件立即计算给你计算出来。这样一来，你做完实验时，你的分析检测结果也就同时出来，结果准确及时（我已经在我前面博文中有介绍）
  七、对于色谱仪器的故障和对策：
    1、 基线走不直的情况，最主要有以下几个原因：流动相污染或流动相混合不均匀、检测器污染、色谱柱平衡时间不够，走基线时，有时候出现有规律的有相同时间间隔的小尖峰出现，这你可以去查下检测器和色谱工作站的连接是否好，连接不好或接触不良，也出现这种情况的。还有柱温箱是否打开，也有点影响走基线，不过没前面影响显著。检测器能量不够等
    2、保留时间漂移，主要有以下几个原因：柱温箱没有开启或者是柱温箱温度还没有平衡或柱温箱的恒温功能失常、流动相没有充分平衡色谱柱、泵失常或泵内有气泡，影响流速和泵压，造成流速达不到、色谱柱塌陷造成死体积的增加，影响柱子的分离效果、色谱泵的柱塞杆密封环磨损、管路的些许泄漏等。
    3、峰变形，最主要有以下原因：色谱柱筛板会柱头固定相污染造成峰变形的主要因素、流动相配制不正确和流动相被污染。
    4、峰平头的情况很简单，主要有：检测器的灵敏度（range）或量程（auxrange）设置过小、进样量过大等。
    5、不出峰的情况主要有：流动相配比不正确、有机溶剂太少，出峰时间过长、管路泄漏严重。
    6、峰基线平直却无杂质峰且主峰起点垂直上升的主要原因是：进样后没有按检测器的自动调零“autozero”引起。
    7、峰面积突然变小的情况主要有：进样器的六通阀堵塞，影响进样量、管路泄露（一般伴随有保留时间增长的现象，好判断）。
    8、柱压变大的主要原因：管路过滤器堵塞、色谱柱污染筛板堵塞、检测器污染堵塞、管路堵塞、吸滤器堵塞等，检查的方法是：从检测器段开始检查，采取排除法检查，找出堵塞源。管路过滤器堵塞、色谱柱污染筛板堵塞、检测器污染堵塞、管路堵塞、吸滤器堵塞采取拆开冲洗的办法进行。
    9、  柱压突然变小，最常见的原因是：管路泄露或色谱柱连接头松动、色谱泵内突然进入气泡。
    10、 柱压升不上的主要原因是色谱内存有气泡、单向阀堵塞、柱塞杆损坏或柱塞杆密封环磨损漏气、管路连接松动漏液等。
    11、 柱压上下来回波动的主要原因：色谱泵内有气泡、单向阀有一个堵塞。
    12、 检测器自检时出现找不到656nm校正峰时，主要有以下原因：D2灯能量不足、检测器安装D2灯处面板没盖好或关紧好、检测池污染（采取冲洗办法）。排除以上因素后再按shift+calbium进行重新校正，可能可以通过。
    13、对于岛津液相色谱仪器，检测器出现“over”的情况主要是初始值小于0，采取按zero和调剂检测器极性的办法进行排除。
    以上是液相色谱仪器使用中最常出现的异常情况，所以介绍这些，仅供参考。
  八、做色谱检测分析应具备的良好实验习惯和素质：
  1、养成经常不冲洗仪器和色谱柱不罢手的习惯，特别是色谱柱和管路，防止色谱柱污染和管路堵塞。
  2、养成流动相滤过和流动相排气的良好习惯。
  3、养成定期冲洗管路、冲洗和活化检测池的良好习惯。
  4、定期超声清洗管路过滤器的习惯。
  5、养成10%甲醇水或乙腈水（40min以上）---色谱甲醇或色谱乙腈（30min以上）的冲洗习惯。特别是针对反相液相色谱。
  6、养成开泵先排气泡的习惯。
  7、养成小频度的增加流速的习惯，不要剧升剧降来进行加减流速，以防损坏泵和色谱柱。

目前，气相色谱(GC)已是一种相当成熟的分离分析方法，不仅在小分子有机物的例行分析和科学研究中得到了广泛应用，也正逐渐在无机物分离分析中得到重视，从而使GC的应用领域不断扩大，主要包括药物分析、环境分析、农业和食品分析、有机化学品分析、法庭和毒品分析、医学和生物分析、塑料和聚合物分析、无机化学品分析、石油分析等。本文对GC7890Ⅱ型气相色谱仪使用过程中出现的色谱柱(VB-5，美国VICI公司)不出峰的异常现象进行分析，着重介绍了造成故障的原因和排除故障的方法。
1 故障主要现象
    按照纺织品禁用偶氮染料检测方法中的前处理方法对纺织品样品进行预处理，然后将萃取液在气相色谱仪上按照纺织品禁用偶氮染料检测方法设置的色谱工作条件进行气相色谱分析，并多次重复进样，都发现色谱图中主要只有溶剂峰。使用2 mg／ml的芳香胺标准溶液在同样的工作条件下进行色谱分析，结果也只有溶剂峰，从而确定色谱柱出现了问题，导致该色谱柱对芳香胺等物质没有办法进行分离分析。
2 故障分析及排除
    在注射芳香胺标准样品时仍然难以获得相应组分的色谱图，但是能够获得溶剂峰，表明氢火焰离子化检测器（FID）和相应的电气系统能够正常工作，因此推断问题主要出在色谱柱及与其分离功能相关的部件。
2.1 玻璃衬管污染
    玻璃衬管(glass insert)是气相色谱的关键配件之一。玻璃衬管位于进样口的汽化室内，其功能是提供一个温度均匀的汽化室，防止局部过热。样品从注射器进入仪器后，样品中的成分在汽化过程中首先就要和衬管以及衬管中的石英棉接触。因此，如果衬管和石英棉被污染，其附着的杂质则容易与待测物相互作用，使之产生吸附、催化降解等过程，对于大量组分则能够显著降低其浓度，而对于微量和痕量组分则可能将组分完全吸附产生不出峰的情况，从而直接影响分析结果的准确性。
    一般来说，待分析的有机物在高温下会分解并残留下杂质，这些杂质主要以碳及其聚合物的形式附在玻璃衬管的内壁上，所以被污染玻璃衬管的内壁上通常是黑色的。将仪器的玻璃衬管拆下来后，并没有发现明显污染的痕迹，但在玻璃衬管的中部发现少许硅橡胶碎屑。这是因为在多次进样后，一些硅橡胶碎屑会被进样针头带人衬管，积累多了还会导致载气堵塞，需要及时清除，尤其是硅橡胶密封垫质量不好时更严重。将仪器的玻璃衬管和玻璃棉更换后重新实验，可是情况并没有显著改善。可见，该异常现象主要由其它原因引起。
2.2 色谱柱的固定相流失
    毛细管柱中被测物质各组分在不同两相间分配系数(溶解度)的微小差异，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组分就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组分的吸附或溶解能力不同，因此各组分在色谱柱中的运行速度就不同，然后通过载气温度的升高，待测物质按照沸点由低到高逐渐被洗脱出来。如果固定相流失，将无法有效地吸附待测物质。将非极性组分构成的混合标准溶液在色谱仪上按照相同的色谱工作条件进行气相色谱分析，发现所有的物质都能被很好的分离(如图l所示)。在另一台色谱仪上用同种型号的新色谱柱按照相同色谱工作条件进行气相色谱对照分析，获得的色谱图如图2所示。比较图1和图2后发现，两台气相色谱仪所得色谱图的保留时间、峰高的比例关系一致，表明旧的色谱柱的固定相正常，能正常的分离由这些非极性组分构成的混合组分。因此，该色谱柱不能够分离以极性组分如芳香胺为主的混合物，应该是其它原因所导致。


2.3 色谱柱污染
    在做纺织品样品前处理时，由于待处理的样品具有复杂多样性，如沸点差异很大的芳香胺等。当这些组分进入色谱后，高沸点的杂质吸附在固定相上，正常工作时的色谱条件很难将其洗脱出来，从而影响固定相与待分析组分的吸附。当这些杂质的含量较高时甚至会阻碍固定相与待分析组分的相互作用。检查仪器的使用日志后发现实验中一直做的都是不同纺织品样品的检测，色谱柱被污染的可能性较大。通常解决色谱柱被污染的最佳方法就是重新老化色谱柱，在相同的色谱工作条件下，设置色谱柱老化的程序（柱温从50℃开始，以5℃/min的速度升温，达到340℃时保持30min）进行程序升温，结束时在相同的工作条件下进甲醇，在相同的色谱工作条件下进行色谱分析，结果发现甲醇的溶剂峰出现在约2．2 min，而在35—65 min区间内还出现了许多具有显著丰度的高沸点杂质的色谱峰。之所以在甲醇的色谱图上能找到这么多的色谱峰，是因为平时实验的样品物质，也被大量的吸附在固定相上，通过载气温度的改变，并没有将色谱柱中待分析的样品全部洗脱出来。当进甲醇样时，按照相同的色谱工作条件设置的程序进行色谱分析，结合载气温度的变化将部分高沸点物质洗脱出来。实验表明，甲醇虽然能够将色谱柱中大量存在的杂质进行部分洗脱，但是经过多次洗脱后进甲醇样仍然能够获得类似的谱图，表明这些杂质仍然存在于该色谱柱中。为了获得更好的洗脱效果，连续使用好几种溶剂(乙醇、甲醇乙醇l：1混合、乙醚)，都能得到在35—65 min区间有显著丰度的高沸点杂质的色谱峰，说明色谱柱中的杂质还没有完全被洗脱干净。因此，为了确保将这些难洗脱物质进行彻底清除，需要在清洗色谱柱后继续老化色谱柱。在相同的色谱工作条件下，重新按照设置的色谱柱老化程序重新升温进行老化，然后空运行平时做样品分析时设置的色谱条件进行程序升温，发现基线平稳，且没有色谱峰。重新采用标准芳香胺溶液和实际待测样品进样，如图3所示，发现待测样品能够获得理想的分离效果。因此，故障得以排除。

3  结论
    随着GC越来越广泛的应用，GC故障的排除有一个不容忽视的重点，尤其是当采用的色谱柱比较昂贵或难以快速获得时，主动地排除这些仪器的故障有利于节省大量时间和金钱，显著提高工作效率，降低分析成本。通过对以上故障的分析，给出以下建议：1、老化色谱柱需要有耐心，且需在老化结束后及时地检查基线的情况，确保色谱柱老化完全；2、定期将色谱柱空运行程序升温，减少其被污染的几率。

2  输液泵的常见故障及对策
　　输液泵/高压泵是保证HPLC系统流路畅通、流量精确和压力稳定的重要仪器部件，日前多用往复式恒流柱塞泵，主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单向阀组成，用马达带动凸轮驱动柱塞杆作吸液和排液的往复运动。常分为单柱塞泵、并联柱塞泵、串联柱塞泵和柱塞隔膜泵等类型。流动相混合方式分为低压混合和高压混合。常见泵的故障主要有以下几种，并提供解决的办法。
2．1  单向阀故障  由于球与阀座密封不严，液体倒流，造成压力不稳，甚至球与阀座粘在一起阻死。密封不严主要是污染或气泡引起，球与阀座粘连也是由于污染和磨损造成。
　　为避免单向阀中的宝石球和阀座被污染，流动相应使用HPLC级的溶剂，并且配好的流动相一定要用0．45u滤膜过滤和脱气。如果泵被微粒污染，可分别用水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷依次冲洗。冲洗时应打开泄液阀，最后再用所用的溶液冲洗整个系统。
　　气泡进人阀中会紧贴在阀体的一侧，使宝石球难返回到阀座，引起倒流，泵的压力和流速会明显改变。此时，应立即打开泄液阀，大流量（2ml/min）冲洗泵，直至排除液为直线型。因为甲醇可润湿泵内壁，挤出气泡，故也可使用脱过气的甲醇冲洗泵。长期不用的泵或新装的泵头应该用甲醇赶气泡。泵进气泡也可在泵头上排气泡，即用扳手固定住进气泡的泵头，拧开输出管道的压帽，手动泵送液，可见到气泡从孔中挤压出来，直至无气泡排出将压帽拧紧[3]。
　　采取上述办法仍不能使压力稳定，应考虑是否密封垫坏了?或单向阀磨损、球不光滑等，需更换部件。
2．2  泵垫圈故障  泵垫圈常见的故障是渗漏和垫圈受损污染系统。液相色谱系统一般情况下不要使用强酸强碱溶液，因为这会损坏密封垫和柱塞杆。密封垫圈与运动着的柱塞杆紧密接触，可使柱塞在泵头自由运动而流动相不漏出来，它是液相色谱系统中最易磨损的部件。有条件的实验室可三个月更换一次垫圈，防止泵系统污染。如果用缓冲盐作流动相则更会加速垫圈的磨损，应及时冲洗。当垫圈损坏时，表现为：泵压力不稳、泵头漏液。一旦出现这个现象，应尽快更换新垫圈。
　　为避免上述故障的发生，我们在分析工作中应注意以下几点：
　　①使用超纯水（18MΩ．cm）、纯度级别较高的试剂和色谱级溶剂配制流动相；
　　②配好的流动相一定要抽滤脱气，即便仪器有在线脱气装置，也最好在卜机前进行抽滤。真空抽滤既过滤颗粒也脱了气泡，非常有效。
　　③泵在起动前一定要通过泄液阀抽净泵里的空气。
　　④用缓冲盐洗脱时，分析结束后一定要用水冲洗泵和整个流路系统，不要让腐蚀性溶液滞留泵中，最后用有机溶剂充满系统。

色谱分离柱的使用与维护
　　作为HPLC分离过程的核心，稳定高效的色谱柱和固定相是建立适应范围广、重现性好的分析方法的基本保证。色谱柱在使用过程中常出现的问题主要涉及到：色谱柱的寿命、保留时间与分离度的重现性，色谱峰脱尾等。
3．1  色谱柱的寿命
　　色谱柱使用过程中，会由于各种原因导致分离失败或色潜柱失效，主要表现有：色谱柱反压增高、峰脱尾、塔板数下降、保留值降低等。造成这些问题的原因主要有柱滤板问题、强保留组份影响和化学影响等，下面将分别讨论：
3．1．1  色谱柱滤板问题及对策
　　色谱柱入口筛板堵塞是色谱柱最常见的问题之一，筛板堵塞会导致柱压升高，色谱峰脱尾、塔板数降低。注射样品中含有微粒杂质，最有可能堵塞色谱柱入口，降低柱寿命，故要在注样前，将样品过滤或离心；进样器与泵密封垫的磨损也会带来微粒，故可在进样阀与色谱柱之间用在线过滤器，常可避免色谱柱滤板堵塞问题。当筛板部分堵塞或进口处填料塌陷形成异常峰形时，可用强溶剂反冲色谱柱（低速）。如不见效，则需更换筛板，或重新填补填料后更换筛板。
3．1．2  强保留样品组份影响及控制
　　强吸附性的样品组分吸附在柱头填料上，能严重地缩短色谱柱寿命，在分析生物体液（如血液、尿液）时尤为突出。这时，可在色谱柱加一保护柱，能够有效减少强吸附组分的污染。保护柱（预柱）是根内装填料与分离柱性质相近的短柱，接在分离柱之前，可代替流路过滤器。保护柱的作用是吸附强保留组分，收集和阻塞化学垃圾进人分离柱，这些垃圾如果直接进人分离柱会逐渐堆积在柱头，最终降低柱效能。保护柱是消耗品，如分析血浆样品，一般分析50个样品后需更换新柱芯。另外，每次分析结束后可用强溶剂冲洗分离柱（应卸下保护柱），以除去可能吸附在分离柱柱头的污物，有效延长色谱柱的使用寿命。
  检测器的常见故障及对策
　　液相色谱仪常用的检测器主要有紫外、荧光和电化学检测器。这些检测器的作用就是收集流经色谱分离柱的各组分在检测器中的信号，根据组分光吸收值/荧光强度/电极表面电流的变化计算出组分的浓度。各检测器常见故障主要有：
4．1  基线噪音较大和时策
　　对于紫外检测器，氖灯光源打开后要预热30分钟以上，基线才能稳定。
　　氖灯用的过久，接近受命期时（氖灯的寿命约束1000小时），会使基线噪音明显增加，应及时更换氛灯。除光源外，流路中的气泡也会产生噪音。怎样判断基线噪音增大是由于光源灯的老化还是来自流路中的气泡?可将泵关匕继续走基线，如果噪音立即停止，基线呈一条直线，说明基线噪音来自流动相中的气泡，应设法排气；若停泵后仍有噪音出现，应考虑是灯的问题。
　　电化学检测器中的工作电极（安培型）对气泡十分敏感，仪器的平衡时间较长。流路中如果有气泡存在，不仅基线会出现尖峰，还会影响检测。因此，做电化学检测时，流动相的配制要很严格，水要超纯、除还原物，配好后一定要过滤脱气，还应现用现配。如果泵系统不是YK材料，即电化学分析专用仪器，而是普通的高效液相色谱不锈钢泵，应对系统中的不钢材料的输液泵、进样器和管道，在分析前用6moUL硝酸溶液钝化（注意断开分离柱），可缩短基线平衡时间。还可在流动相中加入EDTA离子隐蔽剂，也是可以的。如果有较大的气泡进到检测器中，光靠泵冲有时太慢，可暂时将泵停止，关上电化学检测器，拆下工作电极，用超纯水冲洗电极表面，也很奏效的，但对液相色潜技术不太熟练的技术员要小心操作，不宜反复这样拆卸。

4．2  检测器污染及对策
　　管道污染阻塞是检测器常见故障。当流动相用了缓冲盐更换流动相又不当时，常会在检测器管路中产生沉淀．可先用5倍柱积的水冲洗，再用10倍柱积的强溶剂（如乙睛）流过，再用50倍的柱体积的异丙醇冲洗，最后换上反相流动相平衡。当检测器管路堵塞时，可表现为柱压升高，此时，应和柱头堵塞相区分。可断开柱子，直接接检测器，如泵压仍较高，可判断压力升高是由于检测器管道堵塞造成。检测器进口是常发生阻塞的地方，正向冲洗效果常不明显，我们的经验是将检测器进出口管道对调，用6moUL硝酸溶液反冲检测器，能很快将阻塞冲开，但要注意用低流速冲洗，观察压力变化。
　　检测池阻塞和污染多见紫外检测器。池阻塞也可用上述方法反冲，一般都能疏通。通常，池阻塞的故障比较少见，而池污染常发生，如不干净的样品在池窗上积聚等，都会造成检测池污染。表现为基线噪音增大，仪器灵敏度下降。可用注射器依此回抽异丙醇，6mo11L硝酸，要小心操作，将池中的污物冲洗干净，最后用100m1纯水正向冲洗检测池。反向冲洗还可防止池渗漏。对于电化学检测器，要注意维护工作电极表面的清洁度，当检测器检测了大量较脏的样品（如血浆、尿液）或用的过久，应用化学法或物理抛光法对电极表面进行清洁，可提高一定的检测灵敏度，但要注意，最后一定要用纯水冲洗干净，不要带来其它污染。
　　我们仅就有限的篇幅谈了一点从事液相色谱分析工作的经验，供大家交流和探讨。高效液相色谱仪是现代科学研究中广泛使用的分析仪器，但我们必须学会正确的使用和维护，才能更好的驾驭她，让HPLC技术在生物医学领域发挥更大的作用。