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主题：【分享】标准曲线的探讨

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发表于：2012/06/25 17:09:33 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

任何一个色谱方法都需要有标准曲线来建立定量的标准。我们经常讨论有关这方面的问题。但是我们似乎也对这个课题可能没有全面的了解。我不是危言耸听，而事实的确存在。我觉得实在有必要把标准曲线的来龙去脉说个清楚。也希望同行们能够不吝指教。毕竟每个人看法，想法，做法多少都会有出入的。就算我来个抛砖引玉吧。

当然首先我们必须有一个固定的色谱方法，这个方法是以等度色谱为主。重点只是检验主成分。条件是进样量要小，然后走样的时间不超过10分钟（越短越好）。因为进样量小，所以可能出现的杂质或有关物质，我们都无法看到。然后开始看看我们的标准曲线。一般标准曲线的范围是根据我们要分析的靶点浓度(target concentration)来决定。也就是在我们对某一样品进行分析的时候，所采用对照品的浓度。因为我们没有必要在每次分析的时候，都连续进样不同浓度的对照品，建立标准曲线，然后从标准曲线来求得样品的浓度。但是当我们用单一靶点浓度来定量的时候，我们是需要使用标准曲线来检验单一靶点浓度来定量的可行性。那我们如何来决定对照品的单一靶点浓度呢。首先我们使用对照品来决定Quantitation Limit(定量限)及Detection Limit (可测限)。在这里我要强调的就是假设我们要定量主成份（不是杂质或相关物质），因此我们强调的是准确度(precision) 及精确度(accuracy)。所以标准曲线的下限，大概设在高於2到3倍的QL。QL的要求就是在连续进样六次的%RSD要小於1%。有了这下限浓度，我们就可以决定上限的浓度。这时可以看我们分析制剂样品的含量。把制剂的含量，经过稀释后的浓度（1:100 或1:1000) 定为我们的靶点浓度。而这一点最好在标准曲线的中点。美国FDA规定的标准曲线范围只是靶点浓度的上下限百分之五十。如果靶点浓度是10 mg/mL，那上下限就是5 到15 mg/mL。所以看看通常我们做的标准曲线是往往超过这个范围的。

有了对照品的上下限浓度，我们就可以配制两个接近浓度的对照品。一个做为工作对照品(working standard)，另外一个做为检验对照品(check standard, monitoring standard, standard check)。把工作对照品做一系列的稀释，最好有6个不同浓度。每样我们进六针，一共就是36组数据。有了浓度，有了相对的峰面积，我们就可以做线性分析(linear regression analysis)了。有的人把(0,0)算入标准曲线的一点那是不对的。因为即使您打空白样品，没有峯，面积绝不是0。因为，我们使用紫外检测器，是有基线信号的。而我们的检测器无法测出基线的面积啊。测不出来并不表示没有（当然，有人说我们用的检测器可以设置参考波长啊，以后我们可以再讨论）。您看，当我们用一般光谱仪器的时候，我们是可以把空白放在另外一个槽中测吸收值(absorbance)。但是色谱的检测器没有多一个槽，也就无法测量流动相的吸收了呀。您看，RI 检测器就可以把流动相打入槽中做为背景信号啊。

建立了标准曲线，就有两种可能性。一种情形就是曲线经过原点或者非常接近原点。经过原点的这种情况很少。如果您使用長波长，或者使用的有机流动相吸收小。因为基线的吸收小，所以曲线是可以经过原点的。因为，我们看到任何样品的信号其实都包含了基线的信号。如果是这种情形，您可以使用标准曲线上的任何一点来做单一曲线的靶点来定量。而样品的浓度，可以配制到锁定标准曲线浓度内。这时后我们说我们分析的偏差(analytical bias)接近於0。另外一种情形，是我们经常看到的就是标准曲线不经过原点。不经过原点就是说有一定的分析偏差。如果我们要避免偏差，我们就必须要使用标准曲线来定量。也许我们不需要每次用6个浓度，可以缩小为三个点，但是必须横跨下限，中限及上限（必须与6个点的曲线比较而且认证）。这样还是麻烦啊，所以我们想办法只要用一个靶点浓度来定量，而且（与标准曲线比较）偏差不会太大。要达到这一个目标，当然是选择高浓度的对照品。因为，选择高浓度的对照品，基线的信号相对的影响就小。可是，在定量上，我们是希望进量样越小越好，这样不影响我们的准确度，也不至于看到我们不想看到的杂质或相关物质。通常我们就选择中间点，做为我们的靶点浓度了。

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2012/6/25 17:09:53 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

我们把标准曲线做好了，把曲线的方程式求出来，就可以得到一些统计的数据。这个时候我们可以把每个浓度的峰面积带入方程式，求出浓度的实验值。这是实验值与原来配制的浓度比就是我们的回收率。这个回收率是根据标准曲线求出的。回收率当然是应该接近100%的。也就是我们的分析偏差接近於0。另外一方面，我们可以分别使用每一个对照品的浓度，求出该浓度的响应值(response factor)，有了这个响应值，我们可以根据其他浓度的峰面积，求出每个浓度的实验值。有了这个实验值，我们可以与原来的配制浓度求出回收率。您就会发现，以高浓度为对照品来定量低的浓度回收率越小。反之亦然。如果以一个浓度来定量同样浓度，分析的偏差就不存在了。这也就是我们可以选择单一靶点浓度来定量的根据。但是要记住的就是样品的浓度一定要配制到对照品单一靶点的浓度。否则，偏差自然就大了。一般我们做色谱，除了杂质或相关物质。为了能够检测到0.1%的含量，我们通常是需要注射大量的样品。注入大量的样品，自然有许多问题。尤其在定量主成份上。所以，我是主张用两个单独的方法。一个是用来定量主成份，进样量小，时间短的等度色谱法。另外一个就是梯度，长时间，进样量大的方法来定杂质及有关物质。有问题，我一定尽量回答。同时也由衷知道您的想法。

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2012/6/25 17:10:40 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

yuanhejun wrote:
1.标准曲线理论上是过原点，但是实际实验中，操作误差，称量误差，仪器噪音，等等因素可能造成曲线不过原点。y=A*x + B, 当B/A小于20%时候，在统计学上，无显著偏差。当线性下限很低时，可以设定为不大于10%。当这个数值过大时，需要特别注意，搞清楚为什么没过原点，需要给出科学的证明。不能简单的说就是不过原点。良好的线性，专属性和精密度，可以反映出良好的准确性。
2.另外，曲线具有一个范围，但是样品测试还有一个范围，后一个范围必须设在曲线范围之内。这就是我们在平时的测试中，样品浓度的配置范围。两次取样浓度没有必要越近越好，从统计学上来说，方法本身的误差，实验的误差，仪器的误差归结到一起，两次浓度的差异大小并没有对结果的判断产生影响。
3. 当方法的曲线是区间的，就是指不过原点。需要每次测试进行标准曲线的制定。如果说在此区间内，方法线性很好，两点校正是可以接受的。当然，点越多越能反映出该曲线的趋势。只是方法繁琐。反正分析员不值几个钱，不考虑也行。

基本上我是同意先生所言。有一点我要强调的就是统计学在分析化学上的应用。在1978年，我工作的公司还有其他美国其他12个化学公司受美国化学学会分析组及美国环保署的委托，试图订立分析化学方法认证的程序。后来这个变成了分析认证方法的指导原则，美国FDA到了1987年正式采用这个规则。以后有时间我会慢慢写出来。有一点我要强调的就是关于统计学的应用。我们知道一个分析方法的认证，实在无法在一定时间内取得理想的数据的数量(reasonable number of data points)。当然分析时间短的，可以多取得一些数据，分析时间如果超过一个小时一个样品，那24小时基本上就是只有24个点。因此，在我们做统计学的分析到底有多大的意义。当时电脑没有那么发达，所以我们自己设计统计的程序，不过大家就是心里有底，总要有个标准，就这样一直延续下来。譬如我们做线性分析，那个0.9999 跟0.99999，对于24个数据点的意义到底有对大。这都是我们避免去回答的问题。

对于我提到在使用单一靶点浓度对照品来定量样品时，在制备两个样品是的浓度最好接近对照品的浓度，也是当初我们的一个建议。这个建议完全是根据我在文中所提的分析偏差的分析。并没有统计学上的根据。我相信，如先生所言，就是以统计学的观点来演算，使用不同的样品浓度，结果可能也没有多大的区别。

至於分析员不值几个钱，这点可能是先生一时笔误。也许在国内是这种情形。一个分析员的价值在於对产品质量的控制。是不是值钱当然要看对产品的贡献如何。当年，我们一个价值10亿美元的产品，每年必须向美国环保署注册，就是分析方法的改进。过不了关，就是不准继续卖。在那种情况下，分析员值几个钱的说法就不存在了。我自己在分析领域干了32个年头。是不是值钱，我自己心里有数的。目前美国药业的发展，每一个环节，看看如果没有分析人员的后援，又是如何的结果。

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2012/6/25 17:11:26 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1标准曲线的下限。
1.1微量分析现在仪器及技术的不断发展，基本上QL都在ng级了，QL在生物等效性，药动学研究等未知含量分析中对标准曲线的建立帮助很大。但为什么标准曲线的下限，大概设在高於2到3倍的QL。我认为标准曲线的下限应该是最低定量限这个点，这样才有分析意义。

基本上是已经到了pg了。不过我说的是药物的分析。您看做药动学的要求是在15%到20%的准确与精确度。但是我们做药剂含量的要求是1%到2%。如果把低限度往下推，就很难达到%RSD的要求。因为峰面积越小，峰面积的重复性就越难了。当然，做相关物质与杂质是另当别论。而%RSD的要求也比较宽。

1.2 制剂分析
美国FDA规定的标准曲线范围只是靶点浓度的上下限百分之五十。把制剂的含量，经过稀释后的浓度（1:100或1:1000) 定为我们的靶点浓度。我做标准曲线也是超过这个范围的。

有了标准曲线的范围，然后把样本拿来稀释，总是可以稀释到范围之内的。至于1:100 1:1000是举例子。当然要看您取样的多少而决定。

2标准曲线制作
六个浓度，每个六针。现在我使用的仪器是自动进样的，我多次试研证明自动进样的样品响应值的RSD均小于0.5%，标准曲线是否可以调整为六个浓度，每个一针？

六个浓度，每个六针，是在认证时候做的。以后就不必了。我觉得每次六个浓度，每次一针，由响应值来看也是可以的。不过有一点我要强调，我们做系统准确度的时候，不止是在开头做，其实整个进样过程都需要检查的。譬如我有30个样品，开始我做了系统检验，然后每隔5个样品进样，我还是要进样对照品的。所以我说配制两个对照品，然后第一个进样六针，第二个进样三针（两点决定一线。三点决定一个面，就比较有统计的意义了）。然后每个5个样品再进一针第一个对照品。一直到最后一针。这样从头到尾都有对照品的进样，才能说对整个系统有所掌握。

3样品分析
3.1 3个浓度，但是必须横跨下限，中限及上限。
3.2 一个浓度（靶点浓度）并选择高浓度的对照品（进样量少）。
3.3 样品的浓度一定要配制到对照品单一靶点的浓度（减小偏差）。
现在样品配置常采用两种方法：一是取药品最小包装量稀释到靶点浓度；二是取少量样品直接配置到靶点浓度。方法一准确度好，但试剂用量大，操作时间长；方法二简便，节能。先生认为我们应该选择哪一种方法？

如果能够一次配制到靶点浓度，就一次配完上样。手续多一步就增加一次误差。取量太小，就要注意样品的代表性。对液体而言不是问题，对固体制剂问题比较大。一般都是用整个片剂。在所分析的时候，考虑的是如何减少误差，对于节能，省药那都是其次的因素。

3.4 赞同：一个是用来定量主成份，进样量小，时间短的等度色谱法。另外一个就是梯度，长时间，进样量大的方法来定杂质及有关物质。

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