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主题：【资料】【转】解答透射电镜生物制样问题

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发表于：2012/07/27 15:19:29 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
贴点制样方面的东西，需要的可以参考参考！

取材

先从动物体上用新双面刀片切取2～3mm3样品，迅速投入4℃固定液中固定15分钟之后，再将组织切成1mm3小块，放入4℃固定液中固定。这是超薄切片制备的第一步，是为了获取所要的研究对象。它的好坏直接关系到整个实验的成败，因此是非常关键的一步。首先作好充分的准备工作，包括器材和动物的准备，并制定取材计划，明确取材的部位、目的和要求，作到取材时心中有数。在取材过程中严格按照如下的基本要求及注意事项来进行：

1.快速：由于组织离体后，细胞缺氧导致溶酶体破裂而释放大量水解酶，造成组织结构的迅速降解，产生自溶现象。为了尽量保持样品的生活状态，将自溶的程度降到最低，从还有心跳与呼吸的动物体上取下样品后，组织块要争取在30秒内浸入固定液。

2.准确：由于电镜观察范围有限，要求取材时部位要准确，然后在同一个部位取3～5块样品。

3.轻巧：在取材过程中，由于刀片不锋利或者操作不仔细，对样品产生牵拉、挤压等现象所造成的人工损伤都将导致其细胞结构的严重变化，因此在整个取材过程中自始至终动作要小心，器械要锋利。

4.块小：电镜所用固定剂穿透力较弱，为了与固定液的穿透速率相适应，样品块的大小不得超过0.5～1mm3以确保固定效果。

5.低温：为了降低组织和细胞内各种酶的活性，减缓细胞自溶的过程，要求在低温（0～4℃）下操作，所用固定液和器械应预冷。
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2012/7/27 15:19:47 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
固定

电镜是在分子水平上研究细胞的结构和功能的一种手段，因此要精确地保持细胞的生活状态，尽可能地减少细胞的死后变化，使细胞及其细胞内的微细结构完整无损地得以保存。现通常采用戊二醛-锇酸双固定法，这种方法既可以充分发挥戊二醛与锇酸这两种固定剂各自的优点，又能相互弥补不足，因此能够保存细胞绝大部分的微细结构和成分。其具体步骤是：

1.戊二醛前固定：将生物样品先浸入预冷的3％戊二醛（1/15M PBSpH7.4）内4℃下固定2小时，然后在PBS等渗缓冲液中进行漂洗，要求反复多次换液清洗，使样品彻底漂洗干净，并在上述缓冲液中浸泡过夜。

2.锇酸后固定：漂洗后的样品用1％锇酸（0.24M PBS pH7.4）在4℃下后固定2小时，时间不宜过长，否则样品易变脆。固定后亦要经在1/15M PBS＋0.19M蔗糖（pH7.4）等渗缓冲液漂洗15分钟。

固定时间的长短关系到细胞微细结构保存的好坏，因此一定要控制好时间，太长或太短都不行。固定液的用量以能淹没样品为准，约为样品的40倍。固定液过少，组织固定不充分，固定液过多，则又造成浪费。样品经戊二醛固定后呈淡黄色，再经锇酸后固定则变成黑色。
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gl19860312
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2012/7/27 15:22:35 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
脱水

含有水分的生物样品放入电镜的高真空中，样品会急骤收缩并放出水蒸气，这样就会使电镜的高真空遭到破坏，并造成镜筒的污染。为保证镜筒的清洁及包埋介质完全渗入样品，脱水一定要干净、彻底。脱水过程宜缓和而有序地进行，因为脱水时组织细胞内的水分和某些物质将被有机溶剂所抽提取代，若脱水急骤，常易引起细胞中渗透压等条件的剧烈变化，而出现样品猛烈收缩，导致细胞微细结构的破坏。因此要梯度脱水且时间不应过长。具体的脱水程序为：

50％乙醇 5～10分钟；

70％乙醇 5～10分钟；

90％乙醇 5～10分钟；

90％乙醇＋90％丙酮 （1：1） 5～10分钟；

90％丙酮 5～10分钟；

100％丙酮 10～15分钟；

以上步骤均在4℃进行

100％丙酮 10～15分钟（在室温进行）；

脱水剂的用量与固定时要求相同。不同浓度的脱水剂转换时，应先用新液清洗一次，再更换成新液，以免被残余的旧液稀释而影响脱水的效果。如因工作时间安排问题需间隔较长时间，可在70％乙醇中保存过夜。但绝不能在高浓度的脱水剂停留过长时间，更不能过夜，否则会引起组织细胞内物质抽提、变脆造成切片困难。在脱水过程中还应注意不要让样品在空气中暴露太长时间，否则会造成样品干燥，使样品内产生小气泡，致使包埋剂难以浸透，从而影响切片及电镜观察。
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gl19860312
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2012/7/27 15:25:03 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
浸透与包埋

1.浸透：用包埋剂逐步取代样品中的脱水剂，使细胞内外所有空隙都被包埋剂所填充，以保证聚合后，由单体变成高分子物质的包埋剂能对样品内各种结构进行坚固的支持，使其能承受超薄切片的切割和耐受电子束的轰击。

2.将样品置于100％丙酮加等量浸透剂中（不含DMP30），室温浸30分钟。其间宜多振荡，使浸透更彻底。

3.将样品置于包埋剂中（含DMP30），并用玻璃棒或牙签缓慢搅动样品，使包埋剂能充分均匀地浸入样品，在室温中过夜。

4.将浸透好的样品块放入灌满包埋剂的适当模具（如胶囊）中，恒温箱内加温固化。加温时间为35℃，12小时；45℃，12小时；60℃，24小时。

这一环节中最重要的是包埋剂是否能完全、彻底地渗入到细胞内。如果浸透不好，细胞的微细结构将不能被保存，也将影响样品的切割性能，给下一环节的切片带来困难。因此配制包埋剂时，在严格按配方操作，并彻底混匀的前提下，动作应轻柔。若有气泡产生，则应静置让其自然消失。包埋时也应注意将胶囊中的气泡赶到液面上，以免影响包埋介质。包埋中还要注意防潮，保证所用药品和器皿的干燥，使用后的器皿应及时清洗。
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gl19860312
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2012/7/27 15:26:56 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
超薄切片

这是一个为电镜观察提供极薄（约为60nm）的样品切片的过程，它是整个制样程序的中心环节。大部分生物样品只有被切割成超薄切片的形式才能在电镜下进行观察。能否提供理想的超薄切片关系到能否进行电镜观察，以及能否有令人满意的观察效果。在此以前的环节都是为了能给切片提供一个合格、切割性好的样品，而最后的染色是为了增加超薄切片的反差以利观察，因此超薄切片是最重要的环节。超薄切片的好坏与切片机的性能、切片刀的质量、包埋块的切割性能及操作者技术经验等因素密切相关。

1.包埋块的修整：聚合好的包埋块需要除去组织周围多余的包埋介质，使组织露于包埋块的尖端，并将组织块顶面修成适当的形状和大小，再进行切片。

方法：将包埋块夹在专用夹持器上，用单面刀片首先在其顶端修切，暴露出样品，然后在包埋块四面修出与顶面成45度斜面的锥体形，顶端的切面可以大略修成梯形、矩形等形状，并做一记号（如去掉一角），以便于光学定位。

2.半薄切片：为了克服超薄切片的盲目性和电镜视野的局限性，提高电镜观察效果，在进行超薄切片前，需先进行半薄切片并染色，以便在光学显微镜下检查和较准确地选择超薄切片的部位进行光学定位。

2.1 切片制作方法：先在载玻片上涂一薄层牛血清，待其干燥后滴一滴双蒸水。在超薄切片机上使用玻璃干刀切1.5mm左右半薄切片，用镊子将切片转移到水面上，在70～80℃电热板烤干，切片即可贴紧于载玻片上。为防止在下面的染色过程中掉片子，每块样品可切3～5片半薄切片。

2.2 苏木素-伊红染色：

①在切片上滴2.5％过碘酸水溶液，置染色盘中，再放40℃恒温箱10～15分钟，自来水洗5分钟，过蒸馏水，烤干。

②滴苏木素液于切片上，60℃染色20～30分钟，自来水洗5分钟，过蒸馏水，烤干。

③1％伊红滴染15分钟，60℃，自来水洗5分钟，过蒸馏水，烤干。

④中性树胶封盖。

在制作切片过程中注意要在电热板上烤干片子，而不能让其自然干涸，否则切片将贴不紧，易在染色过程中脱落。过碘酸氧化时，温度应控制在40℃不得超过，氧化的时间亦得严格控制，否则切片会折皱。染色盘中要保持一定的湿度，以防染液蒸干而污染切片或着色不匀。

3.定位修块：光镜下观察染好的半薄切片，选择要进一步观察其超微结构的组织细胞，并找出块上的相应位置，在显微镜下用双面刀片将周边其余的组织修去，留下进行超薄切片的组织面积不要大于0.5mm2。

4.超薄切片的制作：

4.1 清洗铜网：将曾使用过的铜网先用浓HCl浸泡5分钟，自来水洗数次，无水丙酮泡洗后，铺于滤纸上自然晾干，待用。清洗的目的是为了去除铜网上旧的支持膜、切片和其它污染物，以便支持膜与铜网得以牢固的贴附。

4.2 制备支持膜：铜网上需铺一层支持膜以承载面积很小的超薄切片，使之有所依附而得到稳固。支持膜的厚度约为10nm，太薄时易出现切片漂移或被电子束打破的现象，太厚时则会降低图象的分辨率。其方法是：先将干净载玻片浸入0.4％火棉胶醋酸异戊脂溶液中，提出载玻片并直立于滤纸上待干后即在载玻片上形成薄膜。用镊子尖沿玻片边缘划断膜的四边，将载玻片插入玻璃平皿的双蒸水中，使薄膜与载玻片剥离而漂浮于水面上；再将洗净的铜网凸面贴膜，排列于膜上，最后用干净载玻片捞起支持膜及铜网，烤干备用。

4.3 切片：用45度角玻璃刀，以6度间隙角在超薄切片机上切片，切片厚度为60～70nm，在显微镜下呈银白干涉光。用睫毛拨针将水槽液面上的切片聚拢起来，再用铂金环将其捞于环上，借助环上水的表面张力，使切片保持平整，而后贴到载网上，最后将载网置于滤纸上晾干，则切片就附于网上。

切片的厚度要适当，较薄的切片分辨率较高，但反差较弱；而较厚的切片反差虽好，但分辨率则较差。切片速度的控制也很重要，通常为2～5mm/秒，以避免速度过高时刀与样品块之间发生一种高频振动而导致切片出现颤痕。没有颤痕、皱褶、重叠、刀痕及空洞，厚度适中，薄厚均匀，结构清晰是理想超薄切片的衡量标准。由于样品的取材、脱水、浸透、包埋和切片诸个环节、各种因素都会影响到切片的质量，因此优质超薄切片的获得，离不开每个环节的规范操作。
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2012/7/27 15:29:10 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
染色

由于透射电镜是根据电子束照射到样品后，样品各部分散射电子的多少来成象的，而生物组织是由碳、氢、氧、氮等轻元素所组成，散射电子能力较弱，未经染色的片子电镜下反差很弱，难以看清微细结构。因此需要用铀、铅等重金属进行电子染色，以提高细胞结构成分的反差，增强图象的清晰度，使各种组织成分达到满意的染色效果。常采用醋酸铀-柠檬酸铅双染法。

1.准备：将一面刻划有小缝隙的硅胶板插入比其稍短的塑料架上，使板呈拱形隆起，其上的小缝张开，再将捞有切片的铜网插入此缝隙中，仔细取下硅胶板使其复平，铜网即被夹于其中。然后用双蒸水浸洗一次，滤纸吸干。

2.双染：将上述的硅胶板放入醋酸铀染液的试管中，加盖，避光染色10分钟，取出硅胶板，双蒸水冲洗20秒，滤纸吸干，再以同样方式染柠檬酸铅10分钟。最后双蒸水洗20秒钟，滤纸吸干，自然干燥备用。至此常规电镜样品的制备完成，可上电镜观察。

染色时应注意密封以减少污染，特别是铅染液很容易与空气中CO2分子反应生成碳酸铅沉淀物，造成切片的污染。醋酸铀在光照和高温下不稳定，因此铀染时应注意避光。
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