快速导航采购仪器提醒

生命科学仪器综合讨论

版主:

入住本版

专家:

仪器信息网

居民列表

仪器社区 > 生命科学仪器 > 生命科学仪器综合讨论帖子详情

快速回复发表新帖最新帖

返回列表

主题：【资料】外源基因在大肠杆菌中的表达

浏览0 回复4 电梯直达

省部重点实验室

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

发表于：2012/10/02 20:24:41 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上

（一）PCR引物设计的基本原则与PCR反应组分和条件

1. PCR引物设计的基本原则

（1）引物与靶基因间配对的碱基一般为15-20。

（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G + C含量宜在45-55%左右。

（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3’末端不应有互补链存在。

（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。可用计算机进行辅助检索分析。

（5）引物3’末端一般以单个C或G结尾。

2. PCR反应组分和条件

PCR反应体系一般选用50 μl体积，其中含有：

10×Reaction buffer，5 μl

2个引物，各12.5-25 pmol (终浓度各0.25-0.50 μmol/L)

4种底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各200μmol/L

模板DNA，100 ng左右

Taq DNA聚合酶，2.5-3 U

PCR反应条件一般为：

（1）94℃，5分钟

（2）94℃变性30-60秒

（3）50-55℃退火30-60秒

（4）70-72℃延伸30-60秒

（5）72℃5-10分钟

共进行25-35次循环。循环是步骤（2）和（4）

该帖子作者被版主 zhang8826857加 1积分， 2经验，加分理由：鼓励在本版块发帖交流

0
赞贴
4
回帖
0
收藏
0
拍砖
版主
招募

为您推荐

近期热榜

热门活动

您可能想找: 气相色谱仪(GC) 询底价

选参数看心得找厂商查方案

专属顾问快速对接

立即提交

可能感兴趣

省部重点实验室

禁止发帖修改昵称

ID：gl19860312

行业：其他

积分：0升级还需100积分

声望：0升级还需100声望

注册时间：0000-00-00

最后登录时间：0000-00-00

进入iLog 私信关注

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

2012/10/2 20:25:12 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

(二) 质粒DNA的小量制备

1、传统方法

（1）用灭菌牙签挑单菌落于3 ml LB培养液中，37℃培养过夜。

（2）在每个EP管中倒入1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心1分钟以收集菌体。

（3）将菌体重悬于100 μl 4℃预冷的溶液I中，并加入200 μl新配制的溶液II, 盖紧管口，快速颠倒离心管6-7次，然后，冰浴5分钟。

（4）加150 μl 4℃预冷的溶液III, 倒置5-6次以混合内容物，然后，冰浴5分钟。

（5）12,000 rpm 离心10分钟后，小心吸取上清至另一EP管中。

（6）加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置5分钟。

（7）12,000 rpm离心5分钟后，移去上清，并用70%乙醇漂洗DNA沉淀。DNA沉淀自然干燥，并溶于20 μl 双蒸水或1×TE缓冲液 (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。

2. Promega公司Wizard Plus小量DNA纯化方法-离心方案（适用于产品A1330，A1340，A1460及A1470）

（1）12,000 rpm离心1分钟，以沉淀1-10 ml过夜培养物。

（2）用250μl Cell Resuspension Solution充分悬浮大肠杆菌细胞。

（3）加250μl Cell Lysis Solution，倒置5-6次混合。

（4）加10μl Alkaline Protease Solution，倒置5-6次混合，室温放置5分钟。

（5）加350μl Neutralization Solution，倒置5-6次混合。

（6）室温，最高转速离心10分钟，回收上清。

（7）将离心柱插入收集管中。

（8）将上清倒入离心柱中。

（9）室温，最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。

（10）加750μl Wash Solution（加乙醇），最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。

（11）重复步骤（10）（用250μl Wash Solution）。

（12）室温，最高转速离心2分钟。

（13）将离心柱插入一个无菌的1.5 ml微量离心管中。

（14）在离心柱中加50-100μl Nuclease-Free Water，室温，最高转速离心1分钟。

（15）DNA溶液保存在-20℃备用。

赞贴

拍砖

省部重点实验室

禁止发帖修改昵称

ID：gl19860312

行业：其他

积分：0升级还需100积分

声望：0升级还需100声望

注册时间：0000-00-00

最后登录时间：0000-00-00

进入iLog 私信关注

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

2012/10/2 20:26:33 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

(三) 质粒DNA的中量制备

1. 在100 ml 含100 μg/ml 氨苄青霉素的LB培养液中加入1 ml pET-15b/Novablue甘油菌，37℃培养过夜；

2. 4℃, 4,000 rpm离心10分钟以收集菌体；在菌体用3 ml 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0) 充分悬浮后，加入6 ml 溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1% SDS)，并倒置混合，冰浴5-10分钟；

3. 加入4.5 ml 溶液III（60ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸和28.5ml水），轻摇混合，冰浴10分钟；

4. 4℃，12,000 rpm 离心20分钟，小心吸取上清至另一个50 ml离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟；

5. 室温，10,000 rpm离心10分钟以沉淀DNA；

6. 在沉淀用70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于0.3 ml 的TE (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 缓冲液中，然后转入EP管中；

7. 加入等体积的5 mol/L LiCl, 室温，10,000 rpm离心10分钟以沉淀大分子RNA分子；

8. 回收上清，加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，12,000 rpm 离心5分钟以沉淀DNA；

9. DNA沉淀用70%乙醇漂洗，然后，自然干燥；

10. DNA沉淀溶于200 μl含50-100 μg/ml 胰RNA酶的TE缓冲液中，在37℃保温30分钟；

11. 加入等体积的13% PEG8000/1.6 mol/L NaCl, 室温放置5分钟；12,000 rpm 离心10分钟以沉淀DNA；

12. 小心移去上清，DNA沉淀溶于200 μl TE (pH 8.0) 缓冲液中，并用酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提一次；小心将上层溶液转移到一个干净的EP管中，并加入0.1体积的3mol/L NaAc (pH 5.2)和2倍无水乙醇，混匀，-40℃放置30分钟；

13. 12,000 rpm 离心5分钟以沉淀DNA；DNA沉淀用70%的乙醇漂洗，自然干燥，并溶于100 μl TE 缓冲液中。最后，用1%的琼脂糖凝胶电泳对DNA进行定量和纯度鉴定。

赞贴

拍砖

省部重点实验室

禁止发帖修改昵称

ID：gl19860312

行业：其他

积分：0升级还需100积分

声望：0升级还需100声望

注册时间：0000-00-00

最后登录时间：0000-00-00

进入iLog 私信关注

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

2012/10/2 20:29:15 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

（四）DNA（PCR产物或质粒）的酶切

1. 一般在15-20 μl体积中酶切0.2-1 μg的DNA，可根据实际情况，按比例放大酶切反应的体积和DNA的量。

2. 一般用7-8 u的限制性内切酶酶切1 μg的DNA，酶:DNA的比率应小于25u/μg，以防止star activity。

3. 限制性内切酶一般保存在50%的甘油中，而大于5%的甘油可能会引起star activity或抑制酶切反应。因此，在酶切反应体系中，甘油的浓度一般应小于5%，也就是说，限制性内切酶的体积应小于酶切反应总体积的1/10。

4. 对于双酶切反应，可考虑在同一种缓冲液中进行，一般要求任一一种限制性内切酶的活性不低于其最大活性的50%。

5. 酶切反应的时间一般为2-3小时。如果酶切不完全，可适当延长酶切反应的时间。

（五）从琼脂糖凝胶或PCR反应物中回收DNA （用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System—适用于产品A9280、A9281及A9282）

1. 从琼脂糖凝胶中切下含DNA的胶条，并放入一洁净的EP管中。按每10 mg胶条加10 μl的Membrane Binding Solution，漩涡震荡，并在50-60℃保温直到胶条完全溶解；对于PCR反应物，可直接加等体积的Membrane Binding Solution混合。

2. 将SV 微柱插入收集管中，并将上述溶液加入SV微柱，室温放置1分钟。

3. 10,000 g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。

4. 加700 μl Membrane Wash Soluton，10,000 g离心1分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。

5. 用500 μl Membrane Wash Solution 重复步骤4，10,000 g离心5分钟。

6. 小心将微柱插入一洁净的EP管中。

7. 在微柱中加50 μl Nuclease-Free Water，室温放置1分钟，10,000 g离心1分钟。

8. 丢弃微柱，将DNA储存在4℃或-20℃。

赞贴

拍砖

省部重点实验室

禁止发帖修改昵称

ID：gl19860312

行业：其他

积分：0升级还需100积分

声望：0升级还需100声望

注册时间：0000-00-00

最后登录时间：0000-00-00

进入iLog 私信关注

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

2012/10/2 20:30:38 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

（六）PCR产物或DNA酶切片断与质粒载体的连接

1. 常规方法

一般在10μl反应体系中，加酶切并回收的质粒载体50-100 μg左右及1 μl的T4 DNA连接酶（3-5 u/μl），按PCR产物或DNA酶切片断摩尔数与载体摩尔数比约为3:1的比例进行连接。连接反应在13-16℃保温过夜。

2. 快速连接方法

可以通过连接Kit进行。例如，对于Takara公司的连接Kit，可在载体与插入片段的混合液（5 μl）中加入5 μl Kit溶液，16 ℃保温2小时即可。

（七）大肠杆菌感受态细胞的制备

1. 单菌落接种于3 ml LB培养液中，37℃过夜培养。

2. 取2 ml 过夜培养物接种于200 ml LB培养液中，并且，当37℃培养至OD₆₀₀为0.4左右时，转移至250 ml离心管中，立即冰浴30分钟。

3. 在4℃，3,600 rpm离心10分钟，弃上清，加4℃预冷的0.1 mol/L CaCl₂溶液10 ml, 轻摇以充分悬浮细胞。

4. 转移至 50 ml 离心管中，在4℃，3,500 rpm离心7分钟，小心弃上清。

5. 加5 ml 预冷的0.1 mol/L CaCl₂，轻摇离心管以充分悬浮细胞；冰浴2小时后，加4℃预冷的80%甘油至终浓度为15%，混匀分装，并保存于-70℃。

（八）用质粒或连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

1. 常规方法

一般用2-3 μl连接反应物与200 μl 大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴30分钟；42℃热激90秒，冰浴2分钟；加0.5-0.8 ml 的LB培养液，37℃，150-200 rpm振荡培养60分钟；低速离心以沉淀细胞，并移去大部分上清；用移液器吹吸混匀细胞，在9 cm 直径的平板涂布100-200 μl 细胞悬液，并在37℃保温过夜。

2. 快速转化方法

用2-3 μl连接反应物与200 μl 大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴10分钟，42℃热激90秒，冰浴2分钟，然后涂布在含有适宜抗生素的平板上。

（九）转化子的筛选和鉴定

1. 通过Promega公司pGEM-T Vector System的蓝/白斑筛选

（1）在含有适当抗生素90 mm LB琼脂平板中央滴加40 μl 2% X-gal（用二甲基甲酰胺配制）和7 μl 20% IPTG.。如用150 mm平板，则加100 μl 2% X-gal 和 20 μl 20% IPTG。

（2）用涂布棒使溶液均匀地分散在整个平板的表面。然后，在37℃保温1小时，使全部液体消失。

（3）将pGEM-T Vector--插入片断连接反应物转化的大肠杆菌细胞涂布在上述平板的表面，37℃保温过夜。其中，白色菌落表明：细胞中的质粒含有插入片断；蓝色菌落表明：细胞中的质粒不含有插入片断。

2. 转化子质粒DNA的酶切鉴定

用灭菌牙签挑单菌落于3 ml含有适宜抗生素的LB培养液中，37℃振荡过夜培养。吸取1 ml过夜培养物进行质粒DNA的小量抽提，用限制性内切酶酶切检验质粒DNA中是否有插入片断。

3. 以菌落为模板的PCR鉴定

用灭菌吸头挑取少许单菌落细胞，点在PCR管的底部。然后，加入其他PCR组分，进行正常的PCR反应（其中，PCR循环前的反应参数为：95℃保温10分钟），以检测菌落细胞质粒DNA中是否有插入片断。

赞贴

拍砖