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主题：【分享】细胞培养完整手册

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发表于：2012/10/18 20:32:03 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

常用设备

准备室的设备：

单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、 PH 计（测量培养用液 PH 值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。

培养室的设备：

液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（ -80℃ ）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。

必须放在无菌间的设备：

离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、 CO2 孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、 4℃ 冰箱（放置 serum 和培养用液）。

无菌操作基本技术

无菌室的灭菌：

1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用 3‰ 来苏尔或者新洁尔灭或者 0.5 ％过氧乙酸擦拭。

2.CO2 孵箱（培养箱）灭菌：先用 3‰ 新洁尔灭擦拭，然后用 75 ％酒精擦拭或者 0.5 ％过氧乙酸，再用紫外灯照射。

3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各 20-30 分钟。

4.实验后灭菌：用 75 ％酒精（ 3‰ 新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

5.定期检测下列项目：钢瓶之CO 压力；CO2培养箱之CO２浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)；无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。

6.水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。

实验人员的无菌准备：

1.肥皂洗手。

2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋

3.用75 ％酒精棉球擦净双手。

无菌操作的演示：

1.凡是带入超净工作台内的酒精、 PBS 、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75 ％酒精擦拭瓶子的外表面

2.靠近酒精灯火焰操作。

3.器皿使用前必须过火灭菌

4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。

5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。

6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。

器械的清洗和消毒

玻璃器械洗消：

一、新的玻璃器皿的洗消：

1.自来水刷洗，除去灰尘。

2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5 ％稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。

3.刷洗、烘干： 12 小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g ：浓硫酸 200ml ：蒸馏水 1000ml ）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15 次，最后蒸馏水冲洗 3-5 次和用双蒸水过 3 次。

5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。

6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向 15 磅时，维持 20-30 分钟。

7.高压消毒后烘干

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2012/10/18 20:33:18 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

二、旧的玻璃器皿的洗消：

1.刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。

2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液）， 12 小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗 3 次。

3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。

4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出 3-5 分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向 15 磅时，调节电开关维持 20-30 分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）

5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用 75 ％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内 15 磅高压（ 30 分钟）消毒，再烘干备用。

橡胶和塑料：

橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：

1.针式滤器帽不能泡酸液 , 用 NaOH 泡 6-12 小时 , 或者煮沸 20 分钟 , 在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上 ( 凹向上 ) ，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内 15 磅 30 分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。

2.胶塞烘干后用 2 ％氢氧化钠溶液煮沸 30 分钟（用过的胶塞只要用沸水处理 30 分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。

3.胶帽，离心管帽烘干后只能在 2 ％氢氧化钠溶液中浸泡 6-12 小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。

4.胶头可用 75 ％酒精浸泡 5 分钟，然后紫外照射后使用即可。

5.塑料培养瓶，培养板，冻存管.

6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用 70 ％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用 2—3 周时间洗除残留的氧化乙烯。用 20000—100000rad 的 r 射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻 (CoC12·6H2o) 2g ，30％盐酸 10m 1，蒸馏水 88m1 。

注意事项：

1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。

2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。

3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡： A. 泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。 B. 从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。 C. 器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。

细胞培养用液的配制与消毒

器材与试剂：

干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素 . 纯净水系统、电子天平、 PH 计、磁力搅拌器。

具体步骤：

一、水的制备：

细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。

二、PBS 的制备与消毒 ( 也可用于其它 BSS ，如： Hanks ， D-Hanks 液的配制 ) ：

1.溶解定容：将药品（ NaCl 8.0g ， KCl 0.2g ， Na2HPO4·H2O 1.56g ， KH2PO40. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml ，摇匀即成新配制的 PBS 溶液。

2.移入溶液瓶内待消毒：将 PBS 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内 8 磅消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

三、胰蛋白酶溶液的配制与消毒：

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH 为 8.0 、温度为 37℃ 时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25 ％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调 PH 到 7.2 左右）或 PBS （ D-hanks ）液中。搅拌混匀，置于 4℃ 内过夜。

2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（ 0.22 微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于 -20℃ 保存以备使用。

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2012/10/18 20:35:00 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

四、抗生素溶液的配制

1.所用纯净水（双蒸水）需要 15 磅高压 20 分钟灭菌。

2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位 / 瓶，用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉素是 100 万单位 / 瓶，加 5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为 20 万单位。

3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为 100 单位 /ml 。 1 单位＝ 1 微克？

4.细胞库之细胞培养基不加抗生素

5.培养自ATC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。

6.培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。

7.寄送活细胞时，须将培养液充满整个 flask 时，则须添加抗生素。 (penicillin 100 units/ml +streptomycin 100 ug/ml)

8.若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。

9.去除细菌污染之抗生素混合配方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml

注意混合使用后药物毒性会增强。

10.抗生素使用种类与浓度：

　　　　　　　　　　　工作浓度.　　　　储存温度. 　　　　杀灭细菌

penicillin　　　　　　 100 units/ml 　　 -20℃ 　　　　G(+) bacteria

streptomycin 　　　　　100 ug/ml　　　　 -20℃　　　　G(+) and G(-) bacteria

chlotetracycline　　　 50 ug/ml 　　　　 -20℃ 　　　　G(+) and G(-) bacteria

gentamicin 　　　　　　50 ug/ml 　　　　 -20℃　　　　 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma

amphotericin B 　　　　2.5 ug/ml　　　 -20℃ 　　　　yeast and molds

nystatin 　　　　　　　50 ug/ml　　　　 -20℃　　　　 yeast and molds

fungizone 　　　　　　2.5ug/ml 　　　　 -20℃　　　　　 yeast and molds

五、RPMI1640 的制备与消毒：

1.溶解、调 PH 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中 , 并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次 ( 冲洗液一并加入培养基中 ), 充分搅拌至粉剂全部溶解 , 并按照包装说明添加一定的药品 . 然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为 100 单位 /ml 。然后用一个当量的盐酸和 NaOH 调 PH 到 7.2 左右。最后定容至 1000ml ，摇匀。

2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。

3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。

4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于 4℃ 冰箱内待用。

5.使用前要向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液（ 4℃ 时两周有效）。

六、血清：

1.血清的灭火：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在 56℃ 水浴中灭火 30 分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。

血清必须贮存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。

2.一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。

3.瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20℃ 或–70℃ 至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般 50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由－２０ ℃ 直接至３７ ℃ 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。

4.heat-inactivation 是指56 ℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phag℃ytosis, chemotaxis and activation of lymph℃ytic and macrophage cell type。

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2012/10/18 20:36:33 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

5.勿将血清置于３７℃太久，若在３７℃ 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。

6.血清之沈淀物

6.1 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。

6.2 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是小黑点，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在３７ ℃中欲培养此微生物“，但在37 ℃ 环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品应立即停用，更换另一批号的血清。

七、HEPES 溶液：

HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（ N'-a-hydroxythylpiperazine-N'- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的 pH 范围。使用终浓度为 10-50mmol/L ，一般培养液内含 20mmol/LHEPES 即可达到缓冲能力。

1mol/L HEPE 缓冲液配制方法如下：

准确称取 HEPTS 238.3g ，加入新鲜三蒸水定容至 1L 。过滤除菌，分装后 4℃ 保存。

注意：因为现在市售 HEPES 为约 10g 包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内 HEPES 的终浓度仍然为 20m mol/L 。如：称取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，过滤除菌后可完全（ 20ml ）加入 1L 培养液中，或者每 100ml 培养液中加入 2ml 即可。

八、谷氨酰胺：

合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定， 4℃ 下放置 1 周可分解 50 ％，故应单独配制，置于 -20℃ 冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在 4℃ 冰箱中储存 2 周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为 1 ～ 4mmol/L 。可以配制 200mmol/L 谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加至 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶， -20℃ 保存，使用时可向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。

九、肝素溶液的配制：

含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为 50ug/ml 。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为 0.56 克 / 瓶，配制时，可将其溶于 100ml 三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为 ℃ 。使用时，向 100ml 培养液中加入 1ml （精确可加入 0.9ml ）即可。

十、Ⅰ型胶原酶：

0.1 ％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为 Ⅰ 型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入 10ml 小瓶 -20℃ 保存。

十一、明胶溶液：

因为明胶难于过滤，所以配制 0.1 ％明胶溶液必须用无菌的 PBS 配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量 0.1 克（配成 100ml 溶液） — 即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是 01. 的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入 50ml 小瓶中， 4℃ 保存。

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