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主题：【原创】“特色”应用方法-色谱柱表面碳含量和极性对分离的影响

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yigaozizi
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发表于：2012/11/02 11:07:19 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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色谱柱表面碳含量和极性对分离的影响


一 背景

    反相色谱柱如C18是色谱分析工作者在实验中经常使用的工具，但是不同种类的C18色谱柱往往表现不一样。
    本研究的目的是从C18色谱柱的表面性质去揭示影响分离效果的因素。主要考虑的表面性质有碳含量和表面极性（硅羟基数）。

二 实验原理

  通过对阿巴斯甜标准品和酸奶样品中阿巴斯甜的测定，对比不同C18色谱柱的分离效果，结合各种色谱柱的表面性质，从而揭示出二者之间的关系。
右图为阿斯巴甜的结构：



三 实验部分

3.1 样品处理
3.1.1 酸奶样品预处理
  准确称取酸奶5g左右，加入10mL1%三氯乙酸，1mL2%乙酸铅，颠倒数次，6000r/min 离心15min，取上清液于25mL容量瓶，5mLPH=4.3水洗涤沉淀， 6000r/min 离心10min，提取上清液，用PH=4.3水定容。将样品用0.45μm滤膜过滤，一部分直接进液相检测，另一部分留着进行SPE净化处理。


3.1.2 SPE过程
SPE柱：Cleanert C18（500mg/6mL）
SPE过程：
  活化：5mL甲醇，10mL水
  上样：4mL
  淋洗：5mL5%甲醇水
  洗脱：5mL甲醇
  氮吹，4mL pH=4.3水定容

3.2 液相条件
仪器：Agilent HPLC 1200
色谱柱见表1.
流动相：甲醇：水=69：31
流速：0.8mL/min
进样量：20μL
检测波长：208nm

表1 色谱柱相关信息

柱类型

长度/mm

粒径/μm

孔径/Å

%C

比表面㎡/g

封尾

封尾类型

PH

Venusil ASB C18

4.6*250

5

150

12%

200

否

-
0.8-7.5

Venusil XBP C18 (L)

4.6*250

5

150

15%

200

是

2次

1.5-9.0

Venusil AQ C18

4.6*250

5

100

18%

380

是

1次

1.5-9.0

Venusil XBP C18(2)

4.6*250

5

100

18%

380

是

1次

1.5-9.0

四 实验结果

4.1 标液色谱图
  图1及图2是用阿斯巴甜的标准品在四款C18色谱柱上得到的谱图。当我们将流动相得pH从4.3调整到3.0的时候，我们发现除了XBP C18(L)之外，其他色谱柱对阿斯巴甜的保留时间发生了前移。为什么会这样呢？原因是，C18色谱柱除了对阿斯巴甜有反相保留作用之外，还有解离羟基提供的弱离子交换作用。当流动相pH值降低的时候，羟基的解离被抑制，那么解离的羟基的数量减少，这样弱离子交换作用就被消弱了，导致阿斯巴甜的保留时间前移。而XBP C18(L)由于经过两次的封尾，解离的羟基几乎没有，它对阿斯巴甜的保留不依赖于弱离子交换作用，因此当流动相的pH变化的时候，阿斯巴甜在柱上的保留几乎不受影响。



4.2 酸奶样品色谱图
  首先，需要知道几个数据，阿斯巴甜: pKa1= 3.3, pKa2=7.2；硅羟基:pKa= 5；蛋白质:pKa1=3-8?
  当流动相pH值从4.3变化到3时，阿斯巴甜的解离状态变化不大，尤其是其氨基官能团在pH4.3时已经是充分解离了，变成pH3时，解离氨基的数量几乎没有变化。而硅羟基的pKa是5，当流动相pH变成3的时候，偏离其pKa两个单位，使得硅羟基的解离被抑制，提供弱离子交换的作用被抑制，而不解离羟基的数量增加，提供的氢键极性吸附作用增加。而牛奶中的蛋白质种类较多，但是大部分在酸性条件下，会由于羧基解离的减弱，其反相保留作用会增加，因而蛋白质在C18色谱柱上的保留会变强。
  由3.1.1方法处理的酸奶样品进液相检测，也用4根液相柱，流动相PH值由4.3调到3，看看会有什么变化？
    由图3可见，pH从4.3到3，阿斯巴甜在ASB C18上保留时间前移，而蛋白质保留增加，产生了时间上的重叠，导致蛋白质对阿斯巴甜的干扰。

由图4可见，同样，在AQ C18上也是如此。

由图5可见，XBP C18(2)也是这样，不过它由于经过一次三甲基一氯硅烷的封尾，和前两个C18色谱柱相比，情况略微好些。

由图6可见，XBP C18（L）由于阿斯巴甜几乎没有前移，它和蛋白质的分离度虽然减少，但是没有像前面三款色谱柱那样和蛋白质重叠在一起。


4.3 SPE净化样品色谱图
    以上酸奶样品均是经过沉淀蛋白之后，直接进样检测得到的色谱图，由图中可见样品中有大量的杂质，虽然可以通过选择色谱柱、调节流动性条件使得杂质不干扰目标物的检测，但是大量的杂质会影响色谱柱寿命，增加检测的成本。下面我们看看沉淀蛋白之后的样品，经过SPE柱的净化，得到的样品谱图是怎么样的？请看以下对比图。由图7可以明显的看到SPE柱对样品的净化效果，而且实验过程操作也很简单快捷。


五 结论
    根据以上实验展示的规律，我们可以有以下结论：
（1）碳含量的影响：阿巴斯甜的保留时间随着碳含量递增
（2）表面极性的影响：阿巴斯甜和杂质(蛋白质等)分离随着表面极性的减弱越来越好。
（3）没有不好的色谱柱，只有不合适的色谱柱。（所以以后再碰到某根色谱柱不能满足你分离杂质和目标物的目的，第一个想法不应该是否定色谱柱的性能，而是应该想想这根色谱柱适不适合用于这个实验，毕竟要找根万能的色谱柱是比较困难的）
（4）根据样品和目标物去选择合适的色谱柱。
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yuduoling
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2012/11/2 12:54:44 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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yigaozizi
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2012/11/2 13:21:15 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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不错的文章 ，多谢分享了
多谢捧场~这是做一个实验在选择色谱柱的过程中发现的有趣现象，就把它整理了一下~~
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yigaozizi
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2012/11/2 13:22:59 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
在这补充说明一下，文中对比图的横轴我已经调节成一样的啦~可以很直观的看出峰位置的变化。
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yu3226033
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2012/11/2 23:27:15 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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不是重复了?
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yu3226033
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2012/11/2 23:32:30 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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多谢捧场~这是做一个实验在选择色谱柱的过程中发现的有趣现象，就把它整理了一下~~
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2012/11/2 23:56:50 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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Yu老师，谢谢您啦！我去看过Ta的帖子。跟现在的LZ是一个人呢，而且从发表时间来看，还是先发在博纳艾杰尔论坛之后才发到那边去的呢。这个活动允许一稿两投，之前跟网站客服问过，不冲突的。Ta还是可以投到那边去的，(*^__^*) 嘻嘻……
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dahua1981
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2012/11/3 8:20:13 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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也可以重复获奖吗
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yifan1117
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2012/11/3 8:50:38 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
不错，挺认真的，看来不同色谱柱还是影响不小呀。
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2012/11/3 19:59:03 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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也可以重复获奖吗

可以的。不过最好是先发在博纳艾杰尔论坛的或者明确使用了博纳艾杰尔重点产品的也行。当然最好是比较新的文章，要是很早前的文章就不太好了。这个我们在评审的时候会有考核的，呵呵。
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2012/11/3 21:55:31 Last edit by maggiesea
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