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主题：【分享】实战指南——免疫共沉淀篇（进阶）

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发表于：2013/01/08 08:46:04 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1.首先盐浓度至少0.15M或以上。

盐浓度主要指Na盐浓度。有人会问为什么不是钾盐？因为钾盐会更容易跟某些试剂（或离子）形成沉淀，诸如SDS，因此在某些情况下，钾盐会对后续的某些实验带来未知的麻烦，所以一般盐浓度指Na盐。盐浓度过低对某些与染色体结合较牢的蛋白的抽提（非破膜的温和裂解）效率也较差，可能会丢失部分信息；而盐浓度过高又会造成某些相互作用较弱的复合体解体，因此，通常选择0.15——0.3M做细胞裂解。纯化蛋白通常选取0.6M以上进行IP。


小技巧：最初几遍的漂洗buff要和IP时的盐浓度相同。经验上，纯化蛋白时，若用低盐裂解细胞、高盐漂洗去杂质，蛋白丢失较多；所以，一般如前所述。当然，也可以高盐裂解低盐漂洗，但是对除杂质不利。


2.通常IP体系中NP40含量0.2——0.5%。NP40在0.5——1.0%时，染色体很容易析出（很黏，成胶状会裹住beads，同时粘下很多蛋白），用这样的裂解液破碎细胞则可能需要超声。通常由于习惯上避免增加不必要的操作，所以在非必要的情况下，选择前述的浓度区间。


3.可适当添加EDTA，螯合金属离子保护DNA和蛋白。特殊情况下还可选择添加EGTA，螯合Ca2+研究钙相关蛋白。此外，裂解液中甘油浓度一般介于15%-20%之间。


4.很多市售或自制的裂解液过于温和，需要考虑采用机械或者超声等手段提高裂解效率（超声要慎用，可能破坏弱的相互作用）。但是，有些时候裂解液的冻融又可能影响某些弱的相互作用，所以不太建议冻融裂解液——即最好裂解液制备好后立即进行coIP。当然，如果证实冻融无影响可考虑将蛋白样品保存-80度待用，这对实验日程的安排会更平易。


5.裂解产物的蛋白浓度越高越好。前几日回复一贴子，不知道出于什么动因该LZ主动稀释裂解样品的蛋白浓度再IP，所幸不是做coIP。上面提到过表达会制造相互作用的假象，反过来说蛋白浓度过稀，某些相互作用就测不到（不一定是弱的相互作用）。因此，细胞的裂解效率会直接影响实验的结果。通常细胞裂解产物的蛋白浓度可达7-8mg/ml左右，但是更常规的现象是达不到这种浓度；当然不是说低于7-8mg/ml就不能进行coIP，只是需要考虑这一因素。因此，在多数情况下要尽可能避免稀释你的细胞裂解液。
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