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液相色谱（LC）

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主题：[求助]新人:关于亲和色谱柱的填料的基质,该如何入门

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发表于：2006/07/05 16:13:00 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

是进入这个领域的新人.上学的时候学的不只这个专业,现在工作开始做这方面的事情.
具体的是手上有种抗体,想把它偶联到合适基质上,做成针对抗原的亲和柱.
第一步是要筛选合适的基质.我想请教的是,常用的亲和柱的基质有哪些,它们的理化性质怎么样,提供什么基团,对应结合什么基团,如何激活,如何偶联,适用的操作环境(如PH值等),价格,厂家等等这些问题.
不知道有没有这方面的工具书,或者想查阅一些科技期刊的话,哪些比较好,常用的检索关键字词是些什么,既有针对性,有比较全面的找到需要的资料.
谢谢.

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2006/7/6 12:04:00 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

你的问题比较多，是一个关于亲和色谱的基本内容。

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2006/7/6 12:04:00 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

亲和色谱的基本原理
亲和色谱（affinity chromatography）与其它类型的色谱技术有所不同，它是在一种特制的具有专一性吸附能力的吸附剂上进行的色谱。
利用亲和色谱技术分离某一生物分子时，首先必须寻找能够被该分子识别和可逆结合的生物专一性物质，此物质称为配基（ligand）（如酶、辅酶、抗体、激素等）。其次要把该配基以共价键结合到色谱介质（不溶性固体基质，也就是固定相）上，此色谱介质称为载体（carrier）。最后把固定化配基充填在色谱柱内做亲和柱，使要分离的混合物流经该亲和柱，混合物中只有能与配基专一性结合形成络合物的分子被吸附，不能被结合的杂质则直接流出，通过更换洗脱液的方法，促使被吸附物从配基上解吸下柱，从而获得亲合物。亲和色谱主要用于蛋白质和生物活性物质的分离与制备。

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2006/7/6 12:14:00 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

亲和色谱的载体
载体在亲和色谱中的作用是使配基固定化，提供亲和物质和配基之间特异性结合的空间环境，常称为固定相。用作亲和色谱的载体应具有以下特性：
1、载体应该是惰性的，尽量减少物理吸附和离子交换等非专一性吸附；
2、载体上必须有足够数量的可活化的化学基团，这些可活化的基团应能在较温和的条件下与大量配基偶联；
3、具有多孔的立体网状结构；
4、具有较好的物理和化学稳定性；
5、具有良好的机械性能，并且颗粒均匀。
常用的载体有：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃珠等。

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2006/7/6 12:30:00 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

应用实例：2-胰凝乳蛋白酶的提纯
1、亲和吸附剂（Σ-氨基-N-乙酰-Ｄ-色氨酸）的制备：取一定体积的Sepharose4B，加入100mgCNBr。搅拌混合物，滴加2-8mol/L NaOH，使溶液pH维持在11.0。在20℃左右，8-12分钟完成反应。在布氏漏斗中抽滤活化的琼脂糖，然后用20倍体积冷的0.1mol/L NaHCO3（pH9.0）溶液洗涤。将上述活化的Sepharose4B与等体积0.1mol/L NaHCO3（pH9.0并在冰箱中预冷）溶液混合，接着迅速加入α-胰蛋白酶抑制剂（Σ-氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯）。抑制剂的最大用量为每毫升Sepharose 4B 65μmol/L。4℃缓慢搅拌约24小时，而后再用水和缓冲液反复地洗至没有游离的抑制剂为止。制得的亲和吸附剂在50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中保存备用。
2、分离：亲和吸附剂装柱后用50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液平衡（室温）。样品溶于同样缓冲液中并上柱，再应用同样缓冲液淋洗柱子。流速为30-60ml/小时，直至280nm无光吸收时停止洗涤，然后改用0.2mol/L醋酸缓冲液（pH3.0）洗脱。
再上传一个别人的文献。