目的:建立HPLC-ELSD 检测紫菀中紫菀酮的含量方法。方法:采用Diamonsil C18色谱柱以乙腈-水(25∶75) 为流动相;ELSD:流速1.0mL/min,ELSD漂移管温度110 ℃,载气(N2)流速2.8 L/min结果:桔梗皂苷D进样量在0.525~5.25 μg范围内线性良好( r= 0.9998); 平均回收率为95.6%。结论:本法准确、灵敏、重复性好,为桔梗的质量控制提供了依据。
1.2试药
桔梗药材:由市场购买提供。经鉴定符合2010版中国药典规定。
对照品:桔梗皂苷D对照品(购自中国食品药品鉴定研究院,批号:111851-201001)
乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Diamonsil C18色谱柱 (5um, 4.6*250mm),流动相乙腈-水( 25:75) ,柱温30℃,流速1.0 mL·min - 1 ,进样量10μL;ELSD参数: ELSD漂移管温度110 ℃,载气(N2)流速2.8 L/min,理论板数按桔梗皂苷D峰计算应不低于3000。
2.2 对照品储备液
精密称取桔梗皂苷D对照品约10mg, 置25ml量瓶中,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.525mg的溶液,即得。
2.3供试品溶液
本品粉末(过二号筛)约2g,精密称定,精密加入50%甲醇50ml,称定重量,超声处理(功率250W,频率40kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量;摇匀,滤过,精密量取续滤液25ml,置水浴上蒸干,残渣加水20n:。l,微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20rnl,合并正丁醇液,用氨试液50rnl洗涤,弃去氨液,再用正丁醇饱和的水50ml洗涤,弃去水液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇3ml使溶解,加硅胶0.5g拌匀,置水浴上蒸干,加于硅胶柱[100~120目,10g,内径为2cm,用三氯甲烷一甲醇(9:1)混合溶液湿法装柱]上,以三氯甲烷一甲醇(9:1)混合溶液50ml洗脱,弃去洗脱液,再用三氯甲烷-甲醇-水(60:20:3)混合溶液100ml洗脱,弃去洗脱液,继用三氯甲烷-甲醇水(60:29:6)混合溶液100ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至5ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,即得。
2.4线性关系考察
精密量取项下对照品储备液0, 1, 2, 3,4mL, 分别置5 mL量瓶中, 用甲醇定容, 摇匀, 即得5个浓度的对照品溶液, 分别进样10μL, 测定峰面积积分值。以进样量(μg)的常用对数值X为横坐标, 峰面积积分值的常用对数值Y 为纵坐标, 进行线性回归, 回归方程为:Y= 1.399X + 5.028 r= 0.9998桔梗皂苷D进样量在0.525~5.25μg范围内线性关系良好。
2.5精密度
取2.2项下的对照品储备液适量, 用甲醇稀释成0.0525mg/mL的对照品溶液, 连续进样6次, 记录桔梗皂苷D的峰面积积分值, 计算RSD( n= 6)为0.32%, 表明精密度良好。
2.5重复性实验
取桔梗样品1共6份, 每份2g, 精密称定, 依2.3项下方法制备供试品溶液, 进样测定, 外标法计算桔梗皂苷D含量。结果桔梗样品中桔梗皂苷D含量平均值(n=6)为0.28%, RSD为1.4% , 表明方法的重复性良好。
2.6 稳定性实验
取桔梗样品的供试品溶液, 在本文色谱条件下, 每隔4 h进样1次, 共6次, 结果桔梗皂苷D峰面积积分值的RSD(n=6)为0.97% ,表明供试品溶液在24h内稳定。
2.7 加样回收率实验
取已测知桔梗皂苷D含量样品6份, 每份1g, 精密称定。分别加入0.0208 mg/mL的对照品溶液5 mL,依2.3项下方法制备供试溶液, 进样测定, 计算回收率。结果平均回收率(n=6)95.6%,RSD为1.8%。
3.讨论
皂苷类成分紫外吸收较弱,采用高效液相色谱(HPLC) 方法利用紫外检测器检测,只可在近紫外区测定[3]。2010年版《中华人民共和国药典》首次将桔梗皂苷D规定为桔梗药材的含测指标,采用HPLC-ELSD测定其含量,但并未注明具体实验参数[4],且国内目前有关桔梗液相方面的研究报道较少,所得结论也不一致,特别是以桔梗皂苷D为指标作为某一制剂的质量标准来考察的几乎没有。经方法学考察,表明本法准确可靠、重复性好,灵敏度高,为含有桔梗皂苷D成分的中成药质量控制提供了一种有效的分析途径。
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部.北京:化学工业出版社,2010:229.
[2] 朱丹妮,舒娈,郅慧,等.HPLC-ELSD法测定桔梗中桔梗皂苷D的含量[J].植物资源与环境学报,2001,10(4):11-13.
[3]狄天云, 王刚力, 林瑞超.HPLC- ELSD法测定短葶山麦冬中短葶山麦冬皂苷C的含量[J].药物分析杂志,2011, 31( 1):
[4]丁大勇,高菲等.HPLC-ELSD法测定桑菊感冒片中桔梗皂苷D的含量[J].中国中医药信息杂志,2012,19(3):54