一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此,制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法 1. 凯氏定氮法
2. 双缩脲法
3. Folin-酚试剂法
4. 紫外吸收法
5. 考马斯亮蓝法
三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
(一)试剂: 1. 考马斯亮蓝试剂:
考马斯亮蓝G—250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇,加入100 ml 85% H
3 PO
4 ,雍蒸馏水稀释至1000 ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4.7%(W/V)乙醇,8.5%(W/V)H
3 PO
4 。
2. 标准蛋白质溶液:
纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15 mol/LNaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。
(二)器材: 1. 722S型分光光度计使用及原理。
2. 移液管使用。
(三)标准曲线制作: 1.
试管编号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
100ug/ml标准蛋白(ml) | 0.0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 |
0.15mol/L NaCl (ml) | 1 | 0.9 | 0.8 | 0.7 | 0.6 | 0.5 | 0.4 |
考马斯亮蓝试剂 (ml) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色 |
A595nm |
2. 以A
595nm 为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。
(1)利用标准曲线查出回归方程。
(2)用公式计算回归方程。
(3)或用origin作图 ,测出回归线性方程。即A
595nm =a×X( )+6;一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上。
(4)绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。
(四)蛋白质含量的测定: 样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品的A
595nm ,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A
595nm 值在0.1—0.05之间,所以上述样品如果A
595nm 值太大,可以稀释后再测A
595nm值,然后再计算。
(五)注意事项: 1. 玻璃仪器要洗涤干净。
2. 取量要准确。
3. 玻璃仪器要干燥,避免温度变化。
4. 对照:用被测物质以外的物质作空白对照。
蛋白质含量测定实验难度系数
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