主题：【分享】骨髓间充质干细胞分离培养经验

1 　骨髓间充质干细胞的发现和来源


骨髓组织 中有多种细胞成分， 除基质细胞等已经分化的细胞外，还含有两类多潜能干细胞：造血干细胞和间充质干细胞。 1987 年Friedenstein 等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个细胞在一定条件下可分化为多种类型的细胞，而且经过20 －30 个培养周期仍能保持其多向分化潜能。由于骨髓中的这种多能细胞能够分化为多种中胚层来源的间质细胞, 故称之为间充质干细胞 (Mesenchymal stem cells ，MSCs) , 或间质祖细胞(MPCs) ，是成人多能干细胞的一类。 早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为成纤维细胞集落形成单位(Colony-forming unit-fibroblast ，CFU-F) ，或骨髓基质成纤维细胞(Marrow stromal fibroblast ，MSF) 。 Friedenstein AJ , Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marrow o steogenic stem cells: in vit ro cult ivat ion and t ransp lantat ion in diffusion chambers. Cell T issue Kinet, 1987, 20 (3) : 263 - 267 ]







2 　鉴于其强大的增殖能力及多向分化潜能，可在体外长期培养和遗传背景较稳定，而且用自体干细胞诱导构建的组织不涉及伦理问题，也不存在MHC 限制，所以骨髓间充质干细胞日益受到重视。但是与造血干细胞等其他细胞相比，骨髓中MSCs 的数量非常少，约占整个骨髓有核细胞的十万分之一，并随年龄的增加，细胞数量逐渐减少。因此，如何简便有效地从骨髓中获取高纯度的MSCs 显得尤为重要，寻找高度特异性的MSCs 的表面抗原也就成为MSCs 研究中的一项重要任务和目标。


    不仅如此，一种同样来源于骨髓、贴壁生长、被认为更原始（可以分化为MSCs ）也具有更强增殖能力的干细胞也被鉴定，它就是多能成体祖细胞（multipotent adult progenitor cell (MAPC) or mesodermal progenitor cell(MPC) ） [ Reyes, M., Lund , T., Leuvik, T., Aguiar, D., Koodie, L., Verfaillie,


C.M. (2001) Purification and in vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood 98 , 2615-2625 ] ，因能和MSCs 一起被纯化而统称BM stromal stem cell 。


3  利用流式细胞仪的研究显示,MSCs 属混杂细胞群，其表面抗原也具有非专一性, 它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括: ①黏附分子, 如CD166 、CD54 、CD102 、CD44 、CD106 等。②生长因子和细胞因子受体, 如白介素21 受体( IL-1R ) 、IL-3R 、IL-4R 、IL-6R 、IL-7R 、C 干扰素受体( IFN-CR) 、肿瘤坏死因子(TNF) -A 等。③整合素家族成员, 包括CD49a 、CD49b 、CD49c 、CD29 、CD104 等。④其他如CD90 、CD105 等。不表达造血细胞的表面标志, 如CD34 、CD45 、CD14 、CD3 、CD4 、CD8 等, 也不表达与人白细胞抗原(HLA ) 识别有关的共刺激分子及主要组织相容性复合物类分子如HLA-DR 抗原等。


但到目前为止, 对于MSC 的表面标志尚不完全确定，有些标志尚存在种属特异性，现将普遍认同的不同种属的MSCs 的表面抗原情况综述如下：


表一： MSCs 的表面抗原







HUMAN
RAT
MOUSE
REFERENCE
SH2 +and SH3+














Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J.Orthop.Res. 1991;9:641-650.
CD105+












Barry FP, et al. The monoclonal antibody SH-2, raised against human mesenchymal stem cells, recognizes an epitope on endoglin (CD105). Biochem.Biophys.Res.Commun. 1999;265:134-139.
CD73+



















Barry F, Boynton R, Murphy M, Zaia J. The SH-3 and SH-4 Antibodies Recognize Distinct Epitopes on CD73 from Human Mesenchymal Stem Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 2001;289:519-524.
SH2 + , SH3 + , CD29 + , CD44 + , CD71 + , CD90 + ,CD106 + , CD120a + ， CD124 + ,CD166 +; ⅠⅡⅢ 形胶原 - 、碱性磷酸酶 -, osteopontin-;


脂多糖受体 CD14- 、 CD34- CD45- 。












Dean RJ. Moseley AB. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experim Hematol, 2000,28: 875-884




CD105 + , CD73 +, CD90 + ;






CD45-, CD34-, CD14-




or CD11b-, CD79a -


or CD19-




and HLA class II-.














M Dominici1,et al. Minimal criteria for defining multipotent
mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy.2006,8( 4):315-317





CD29+ and CD44+,
but CD34 _ and CD45 _












Hou M, et al.Transplantation of mesenchymal stem cells from human bone marrow improves damaged heart function in rats. Int J Cardiol. 2007 ,115(2):220-8..
the neural ganglioside GD2 +












Human Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells Express the Neural Ganglioside GD2: A Novel Surface Marker for the
Identification of MSCs. Blood,2006
STRO-1 +












E ncina, N.R., et al . Immunomagnetic isolation of osteoprogenitors from human bone marrow stroma. Lab. Invest. 1999, 79, 449-457.


NGFR+




( nerve growth factor receptor )












N. Querici, et al . Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies, Exp. Hematol. 30 (2002)783�791
CD11b-


( C57Bl/6 mice )












Philippe Tropel, et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from adult mouse bone marrow. Experimental Cell Research 295 (2004) 395� 406
CD105 +

















Barry FP, Boynton RE, Haynesworth S, Murphy JM, Zaia J. The monoclonal antibody SH-2, raised against human mesenchymal stem cells, recognizes an epitope on endoglin (CD105). Biochem.Biophys.Res.Commun. 1999; 265: 134-139.

骨髓间充质干细胞(MSC)原代培养与传代培养
关键词： 骨髓间充质干细胞 原代培养 传代培养 2009-10-06 00:00 来源：互联网 点击次数：4657

准备工作

（1）试管、试管架、滴管、吸管、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、烧杯、橡皮头、剪刀、镊子、纱布、棉球、酒精灯、滴管、移液器、细胞计数器、生理盐水、PBS、双抗（青链霉素）、75%酒精、95%酒精、培养瓶（50ml，260ml）。

（2）BALB/C小鼠（4~5周龄，18~22g，雌雄不限）、胎牛血清（灭活）、DMEM-LG培养液（美国GIBCO）

（3）针头与注射器：4.5号、7号针头（冲小鼠股骨、胫骨和肱骨骨髓，制单细胞悬液）。

实验前准备

（1）实验室消毒，隔离衣消毒，小鼠固定架消毒。配10%FBS培养液，加双抗（内含青霉素、链霉素各100μg/ml）。

（2）用75% 酒精擦拭无菌操作台面，取各种已消毒的培养用品置于超净台面，无菌室及超净台用紫外灯照射30~60 分钟灭菌。

（3）开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。穿隔离衣，戴手套。用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10 分钟后，才可开始实验操作。点燃酒精灯，安装吸管帽。

实验步骤

（1）BALB/C纯系小鼠脱臼处死后，75%乙醇浸泡5min后，在无菌操作台上无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，用10ml注射器（配4.5号针头）抽取适量含10%FBS的完全培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。依次用7号针头和4.5号针头（或依次过21、23、25号）反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液。细胞悬液在1000rpm离心5min后收集细胞或进行密度梯度离心。

（2）将单细胞悬液于1:2比例加到含1.082比重Percoll细胞分离液的离心管中，4℃条件下，经500g密度梯度离心25min，小心收集离心液界面上乳白色云雾状的单核细胞层，加入等量无血清培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤（500g离心5min或180g离心10min）2次，去上清，用10%FBS的培养基悬浮细胞（用0.83%氯化胺破碎红细胞，培养液重悬细胞）。注意：密度梯度离心力500g×30min组优于800g×30min。本步骤可以省略。

附：人骨髓：抽取骨髓10-15ml（或正常人手术肋骨取骨髓3-5ml），每毫升骨髓加100u 肝素抗凝，充分混匀后，保存于4℃冰箱，24小时内分离骨髓MNC。骨髓先加入等量 PBS或Hanks液（或培养液）混匀后，以1份淋巴细胞分离液上面加2份稀释骨髓的比例，将稀释骨髓缓慢加入ficoll液面上（密度1.077），水平离心机20℃条件下500g（2000r/min）离心25~30分钟。从界面上取出的MNC用PBS液洗涤2~3次后，加适量培养液计数。

（3）数细胞数量，达到106~107/ml后即进行原代培养，按5×106/ml浓度接种于50ml培养瓶中（1×106/cm2培养瓶），每瓶含5ml L-DMEM完全培养液。在体积分数为5%的CO2和37℃条件下静止培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每3~4d半量换液1次，10~12d细胞达90%融合时传代。

（4）传代培养：传代时先全部吸出培养液后，用无Ca2+ 、Mg2+PBS液洗涤二次，加入37℃预热的0.25%（2.5g/L，0.25%）胰蛋白酶（含1mmol/L EDTA，即用1mmol/L-EDTA-Na2配制）消化1~2分钟，吸去胰酶，以残留的胰酶继续消化，倒置显微镜下观察，细胞开始皱缩时（细胞开始变圆）加入完全培养液（3ml左右）终止胰酶作用。吸管反复吹打后将细胞收集于15ml离心管中，1500r/min 离心10分钟后弃上清，再用PBS液洗涤二次彻底洗去混有的胰蛋白酶。

将细胞再悬浮于培养液中，按2~5×105/ml再次接种传代于新的培养瓶中。当这些细胞生长接近融合层时，即得到骨髓MSC。传至3~5代的MSC按1×105cells/cm2密度接种于放置有盖玻片的6孔板内，以制备细胞爬片。

注：贴壁细胞的消化，应掌握各类型细胞不同的消化时间，避免过度消化，损伤细胞活力；或消化不足，不能充分解离成单细胞。如为长期实验，每个月重新复苏一支细胞，避免长期传代引起细胞特性变异。

骨髓间充质干细胞(MSC)原代培养与传代培养实验步骤
关键词： 骨髓 干细胞 原代 2013-07-03 19:32 来源：丁香园 点击次数：135


准备工作

（1）试管 、试管 架、滴管、吸管 、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、烧杯 、橡皮头、剪刀、镊子、纱布、棉球、酒精灯、滴管、移液器 、细胞计数 器、生理盐水、PBS、双抗（青链霉素）、75%酒精、95%酒精、培养瓶 （50ml，260ml）。

（2）BALB/C小鼠（4~5周龄，18~22g，雌雄不限）、胎牛血清 （灭活）、DMEM-LG培养液（美国GIBCO）

（3）针头与注射器：4.5号、7号针头（冲小鼠股骨、胫骨和肱骨骨髓，制单细胞悬液）。


实验前准备

（1）实验室消毒，隔离衣消毒，小鼠固定架消毒。配10%FBS培养液，加双抗（内含青霉素、链霉素各100μg/ml）。

（2）用75% 酒精擦拭无菌操作台面，取各种已消毒的培养用品置于超净台面，无菌室及超净台用紫外灯照射30~60 分钟灭菌。

（3）开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。穿隔离衣，戴手套。用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10 分钟后，才可开始实验操作。点燃酒精灯，安装吸管 帽。

实验步骤

（1）BALB/C纯系小鼠脱臼处死后，75%乙醇浸泡5min后，在无菌操作台上无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，在含生理盐水的50mm2 玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，用10ml注射器（配4.5号针头）抽取适量含10%FBS的完全培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶 。依次用7号针头和4.5号针头（或依次过21、23、25号）反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液。细胞悬液在1000rpm离心5min 后收集细胞或进行密度梯度离心。

（2）将单细胞悬液于1:2比例加到含1.082比重Percoll细胞分离液的离心管 中，4℃条件下，经500g密度梯度离心25min，小心收集离心液界面上乳白色云雾状的单核细胞层，加入等量无血清 培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤（500g离心5min或180g离心10min）2 次，去上清，用10%FBS的培养基悬浮细胞（用0.83%氯化胺破碎红细胞，培养液重悬细胞）。注意：密度梯度离心力500g×30min组优于 800g×30min。本步骤可以省略。

附：人骨髓：抽取骨髓10-15ml（或正常人手术肋骨取骨髓3-5ml），每毫升骨髓加100u 肝素抗凝，充分混匀后，保存于4℃冰箱，24小时内分离骨髓MNC。骨髓先加入等量 PBS或Hanks液（或培养液）混匀后，以1份淋巴细胞分离液上面加2份稀释骨髓的比例，将稀释骨髓缓慢加入ficoll液面上（密度1.077），水平离心机 20℃条件下500g（2000r/min）离心25~30分钟。从界面上取出的MNC用PBS液洗涤2~3次后，加适量培养液计数。

（3）数细胞数量，达到106 ~107 /ml后即进行原代培养，按5×106 /ml 浓度接种于50ml培养瓶中（1×106 /cm2 培养瓶），每瓶含5ml L-DMEM完全培养液。在体积分数为5%的CO2 和37℃条件下静止培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每3~4d半量换液1 次，10~12d细胞达90%融合时传代。

（4）传代培养：传代时先全部吸出培养液后，用无Ca2+ 、Mg2+ PBS液洗涤二次，加入37℃ 预热的0.25%（2.5g/L，0.25%）胰蛋白酶 （含1mmol/L EDTA ，即用1mmol/L-EDTA -Na2 配制）消化1~2分钟，吸去胰酶，以残留的胰酶继续消化，倒置显微镜 下观察，细胞开始皱缩时（细胞开始变圆）加入完全培养液（3ml左右）终止胰酶作用。吸管反复吹打后将细胞收集于15ml离心管 中，1500r/min 离心10分钟后弃上清，再用PBS液洗涤二次彻底洗去混有的胰蛋白酶 。

将细胞再悬浮于培养液中，按2~5×105 /ml再次接种传代于新的培养瓶中。当这些细胞生长接近融合层时，即得到骨髓 MSC。传至3~5代的MSC按1×105 cells/cm2 密度接种于放置有盖玻片的6孔板内，以制备细胞爬片。

注：贴壁细胞的消化，应掌握各类型细胞不同的消化时间，避免过度消化，损伤细胞活力；或消化不足，不能充分解离成单细胞。如为长期实验，每个月重新复苏一支细胞，避免长期传代引起细胞特性变异。