主题：【第七届原创】微生物实验室培养基管理制度

制度完善修订中，本文还请各位版友提出宝贵意见！

1. 目的

1.1  本标准操作规程描述了微生物实验室检验过程中所需要用到的各种培养基的接收、配制、储存以及性能验证（促生长试验）的基本要求和操作过程。

1.2  本标准操作规程确保所有实验室使用的培养基符合微生物实验的要求，并确保在有效期内使用。

2. 范围

本标准操作规程适用于微生物实验室外购的培养基。

3. 职责

3.1  微生物实验室主管负责监督和确保实验室在接收、配制、储存和验证培养基时均按照本标准操作规程的要求进行。
3.2  微生物室检验员应熟悉本标准操作规程并严格按照要求进行操作。

4. 程序

4.1  培养基接收

4.1.1  微生物实验室应购买被批准的商品化脱水合成培养基用于各项微生物检验。

4.1.2  培养基接收时，试剂管理员应对照采购计划仔细核查相关信息，并由实验室主管组织检测人员按照本制度4.8条款对购买的培养基进行验证，每批培养基抽取一瓶进行验证。如果培养基出现下列情况：包装破损、培养基泄露、超出有效期或接近最后期限6个月、经性能测试不合格、培养基性状发生改变等，实验室有权拒收此批培养基，并及时与采购部门联系向供应商反馈这些情况。

4.1.3  核对无误后，试剂管理员应当将接收日期、编号、批号、有效期等详细信息登记在《试剂保管帐》上，同时在每瓶/盒试剂上贴上“接收标签”，对接收的培养基进行实验室内部编号。

4.1.3. 1  原则上每瓶培养基需赋予实验室内部唯一编号。编号规则如下：

例如：CM101-140101-01

CM101--------CM是培养基的英文缩写，101是平板计数琼脂的代号。（由于目前实验室采购的多为陆桥的产品，故沿用陆桥对培养基的编号。对于个别其它厂家的培养基重新编号）

140101--------表示试剂接收日期

001-------------流水号（从001开始）

4.1.3.2  培养基瓶体上应标有如下信息，便于清楚地表明培养基的状态

l实验室内部编号

l开瓶日期/开瓶人

l开瓶失效日期

4.1.4  所有的培养基应有相关的COA，试剂管理员应检查和确保COA有效可用。COA应与试剂保管帐放置在一起以便于追溯。

4.2  培养基有效期

4.2.1  开瓶后使用期为一年，或者是供应商提供的有效期（两者取短的日期）。

4.2.2  对于未开封或未用完的培养基，若已超过有效期应予丢弃；在有效期内，任何受潮或物理性状发生明显改变的培养基不应再使用；对于制造商未标明任何有效期的培养基，未开封存放时间不得超过两年。

4.3  储存和采购

4.3.1  干粉培养基比较容易吸潮，有些不宜受热或见光。由于储存状况对培养基的质量有很大影响，应严格按照生产商注明的条件储存，以保证培养基的质量和稳定性。

4.3.2 干粉培养基和可直接使用的培养基通常在低于25℃的环境中避光干燥保存，或将培养基置于冰箱（2-8℃）保存。具体情况请参考试剂说明书或附录2内容。

4.3.3  实验室试剂管理员负责每月检查培养基库存，根据需要及时向实验室主管提出采购申请。

4.3.4  如果有不可预知的额外工作量需要紧急使用培养基，试剂管理员应及时通知实验室主管，主管应立即向供应商下紧急订单。

4.3.5  采购时要求供应商优先提供近期生产的培养基。

4.4  培养基配制

4.4.1  使用培养基时应遵循先进先出的原则。首次开封使用必须标明开瓶日期和开瓶人，并登记于《试剂保管帐》。

4.4.2  配制前仔细阅读培养基使用说明书。

4.4.3  配制前对干粉培养基的外观、颜色、均匀性等进行检查。具体参照相应培养基的质控报告。如有异常情况出现，则按过期培养基丢弃处理。

4.4.4  天平的使用参考作业指导书TC-YQ-M-007《 电子天平操作规程》。

4.4.5  根据培养基的称量数和配制体积数，计算出所需培养基的量，用称量纸称取适量的干粉培养基，卷起称量纸将培养基倒入干净的烧杯或合适的容器中；或用称量勺将培养基直接称在烧杯或容器中，烧杯或容器外应标明培养基名称，易于辨认。注：当天平读数接近称量数时，进行微量加入，以防过量。

4.4.6  称量结束后及时盖好干粉培养基的内外瓶盖，放回原位。（注：SC培养基开封后需置于冰柜内保存）

4.4.7  用量筒量取适量的纯水或蒸馏水，倒入到烧杯或容器中溶解培养基。

4.4.7.1  液体培养基容易溶解，除非有特殊的说明，通常不需要煮沸。

4.4.7.2  琼脂培养基需要加热至完全溶解，加入磁力搅拌棒不停搅拌以防止烧焦，不能长时间加热。

4.4.7.3  实验用水的电导率在25℃时不应超过25μs/cm，pH值为5.0~7.5，水的微生物污染不应超过10³CFU/mL。应按GB 4789.2，采用平板计数琼脂，在36℃±1℃培养48h±2h检查微生物污染。每月至少对实验室用水检查一次。如遇到制水设备维修，维修后进行加测。

4.4.8  用pH计测pH，必要时在灭菌前进行调整，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却至25℃时，pH应在标准pH±0.2范围内。一般使用浓度约为1mol/L的氢氧化钠溶液或浓度为1mol/L的盐酸溶液调整培养基的pH。如需灭菌后进行调整，则使用灭菌或除菌的溶液。切忌反复调节。pH计的使用请参考作业指导书TC-YQ-L-009《Seveny Easy 酸度计操作规程》。

4.4.8  将装有培养基的试管或瓶子包扎好，准备灭菌。注意容器的体积应比培养基体积最少大20%。

4.4.9  在《培养基配制记录》上记录完整的配制信息，包括日期、培养基名称、培养基内部编号、培养基批号、培养基用量、配制体积、调整前后的pH、灭菌条件、配制人、制造商等。

4.5  培养基灭菌

4.5.1  根据生产商使用说明书的要求（温度和时间）对培养基进行高压蒸汽灭菌。某些培养基不能或不需要高压灭菌，可采用煮沸灭菌，如SC等特定的培养基中含有对光和热敏感的物质，煮沸后应迅速冷却，避光保存；有些试剂则不需灭菌，可直接使用；部分试剂需要提前24h制备，如BS平板、XLD平板等，且须在48h内使用（具体参见相关标准或供应商使用说明）。

4.5.2  对于需要煮沸灭菌的培养基，培养基经过两次沸腾即可，以免破坏掉微生物生长所需营养物质。

4.5.3  操作立式压力蒸汽灭菌器时，参考作业指导书TC-YQ-M-018《 LDZM-80KCS型立式压力蒸汽灭菌器操作规程》，开始前应检查灭菌参数（如灭菌时间和灭菌温度等）和水位。

4.5.4  培养基放入立式压力蒸汽灭菌器灭菌之前，将化学指示卡放入相关位置，用来监测灭菌条件是否达到。

4.5.5  灭菌结束后，待压力表指针归零，打开立式压力蒸汽灭菌器门，迅速将灭菌物品取出，避免培养基长时间处于高温状况下。

4.5.6  检查化学指示卡的颜色变化，如果颜色变化不符合要求，则本批灭菌的试剂不得使用，直接丢弃。

4.5.7  除日常采用化学指示卡对灭菌效果进行监测外，实验室应至少每季度使用生物指示剂对灭菌效果进行验证。

4.5.8  操作人员应在《立式压力蒸汽灭菌器使用记录》表本上记录灭菌过程主要信息。

4.5.9  灭菌后的培养基应标有如下信息：培养基名称、灭菌条件、配制日期、有效期、配制人。

4.5.10  培养基灭菌后，不能立即使用的应避光、干燥保存。除特殊说明或标准规定外，通常情况下基础培养基（如使用前添加成分的培养基）应放在5℃±3℃冰箱中保存不超过1个月，或在室温下保存不超过15天，以保证其成分不会改变；不稳定的选择性物质和其他添加成分应即配即用；对化学反应或含有不稳定成分的固体培养基也应现用现配，不可二次融化。琼脂培养基不得在0℃或0℃以下存放，因为冷冻可能破坏凝胶特性。

4.6  培养基使用

4.6.1  在使用配制好的培养基前，应仔细检查。有任何不正常的发现都必须将培养基灭菌后丢弃。同样，在培养基的准备和灭菌时有任何的不正常，也必须将培养基丢弃。

4.6.2  固体培养基灭菌后的再融化只允许一次。将培养基放到沸水浴中或采用有相同效果的方法使之融化。避免过度加热，培养基融化后即可将其从加热器上取下，放入47±2℃的恒温水浴锅中冷却，直至使用。融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4h。

4.6.3  对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至47±2℃时再加入。在加入灭菌的添加成分之前，先放置到室温，避免冷的液体造成琼脂凝结或形成片状物。将加入培养基的所有添加物缓慢充分混匀，然后尽快分装到要使用的容器中。

4.6.4  平板的制备和储存

4.6.4.1  倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成一个至少2mm厚的琼脂层（直径90mm的平皿通常要加入18mL-20mL琼脂培养基）。将平皿盖好后放到一个凉的水平平面使琼脂冷却凝固。如果平板需储存，或者培养时间超过48h或培养温度高于40℃，则需要倾注更多的培养基。

4.6.4.2  凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）用保鲜膜密封后置于5℃±3℃冰箱中（为了避免产生冷凝水，平板应冷却后再用保鲜膜密封。储存前不要对培养基表面进行干燥处理），一般存放2-4周（实际情况应该根据培养基特性和培养基说明书进行存放）。在保鲜膜外部贴上标签，标签内容包括平板名称、制备日期、制备人和有效期等信息。

4.6.4.3  对于采用表面接种形式培养的固体培养基，应先对琼脂表面进行干燥：揭开平板盖，将平板倒扣于烘箱（培养箱）中（温度设为25℃-50℃），或放在有对流风的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。

4.7  培养基处理

4.7.1  实验室配制的培养基(固体和液体培养基)超过使用有效期，应参考MSDS的要求正确处理。

4.7.2  干粉培养基超过使用有效期，应参考MSDS的要求正确处理。

4.7.3  实验室培养基废弃物经121℃，30min高压蒸汽灭菌后处理。

4.8  培养基验证

4.8.1  物理性能

实验室测试至少应包括以下内容：20℃-25℃时的pH；并需要进行观察：加入培养基的量和（或）琼脂层的厚度、颜色、透明度、是否存在肉眼可见杂质、凝胶稳定性（粘稠度）和湿度。

4.8.2  培养基的性能测试

4.8.2.1  非选择性分离和计数固体培养基的半定量测试方法

a)  平板的制备与保存:倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成一个至少3mm厚的琼脂层(直径90mm的平皿通常要加入18mL～20mL琼脂培养基)，需添加试剂的培养基，应使培养基冷却至47℃～50℃后才添加试剂。倾注后将平板放到水平平面，使琼脂冷却凝固。凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和(或) 2℃～8℃冰箱的密封袋中，在有效期内使用。使用前应对琼脂表面进行干燥，但应注意不要过度干燥。

b) 工作菌悬液的制备:将标准储备菌株接种到非选择性肉汤培养过夜作为工作菌悬液。

c) 接种：用1μL接种环按图划线平板。在A区用接种环按0.5cm的间隔划4条平行线，按同样的方法在B区和C区划线，最后在D区内划一条连续的曲线。同时接种两个平板，划线时可在培养基下面放一个模板图，并按标准方法所规定的培养条件进行培养。

操作时用接种环而不用接种针，接种环应完全浸入培养基中。取一满环接种物，将接种环接触容器边缘3次可去除多余的液体。划线时，接种环与琼脂平面的角度应为20°～30°。接种环压在琼脂表面的

     

压力和划线速度前后一致，整个划线应快速连续，移取液体培养物时应将接种环伸入培养液下部分以防止环上产生气泡或泡沫。

通常用同一个接种环对A区～D区进行划线，操作过程不需要对接种环灼烧灭菌。在某些特殊情况下，当期望得到较低的生长指数G时，在A区和B区接种时应更换接种环或对其进行灼烧灭菌。

d)  计算:培养后，评估菌落的形状、大小和生长密度，并计算生长指数G。每条有比较稠密菌落生长的划线则G为1，每个培养皿上G最大为16。如果仅一半的线有稠密菌落生长，则G为0.5。如果划线上没有菌落生长或生长量少于划线的一半或菌落生长微弱，则G为0。记录每个平板的得分总和便得到G。如菌落在A区和B区全部生长，而在C区有一半线生长，则G为10。

e)  结果解释:目标菌在培养基上应呈现典型的生长。目标菌的生长指数G大于或等于6时，则判定培养基可接受。非选择性培养基的G值通常较高。

4.8.2.2  选择性分离和计数固体培养基的半定量测试方法

4.8.2.2.1  目标菌半定量测试方法:按照4.8.2.1中要求进行。

4.8.2.2.2  非目标菌（选择性）半定量测试方法

a)平板的制备与保存:按照4.8.2.1.中a)要求进行。

b)工作菌悬液的制备:将标准储备菌株接种到非选择性肉汤培养过夜作为工作菌悬液。

c) 接种:用1μl接种环取选择性测试工作菌悬液1环，在待测培养基表面划六条平行直线(如下图)，同时接种两个平板，划线时可在培养基下面放一个模板图，按标准规定的培养条件培养平板。

操作时用接种环而不用接种针，接种环应完全浸入培养基中。取一满环接种物，将接种环接触容器边缘3次可去除多余的液体。划线时，接种环与琼脂平面的角度应为20°～30°。接种环压在琼脂表面的压力和划线速度前后一致，整个划线应快速连续，移取液体培养物时应将接种环伸入培养液下部分以防止环上产生气泡或泡沫。
     

d) 计算:培养后按以下方法对培养基计算生长指数G。每条有稠密菌落生长的划线则G为1，每个培养皿上最多为6分。如果仅一半的线有稠密菌落生长，则G为0.5。如果划线上没有菌落生长、生长量少于划线的一半或菌落生长微弱，则G为0。记录每个平板的得分总和便得到G。同时接种两个平板。

e)结果解释:非目标菌的生长指数G一般小于或等于1，至少应达到小于5。

4.8.2.3  非选择性增菌培养基、选择性增菌培养基和选择性液体计数培养基的定性测试方法

a)  培养基的制备:将培养基分装试管，每管10mL。

b) 工作菌悬液的制备:将标准储备菌株接种到非选择性肉汤培养过夜，进行10倍系列稀释至10^-3，或采用其他方法，制备成10⁵CFU/mL～10⁷CFU/mL的菌悬液作为工作菌悬液。

c)  接种:用1μL接种环取一环工作菌悬液直接接种到用于性能测试的液体培养基中。按适合的培养时间和温度进行培养。

d)  结果解释

用目测的浊度值（如0～2）评估培养基。

——0表示无浑浊；

——1表示很轻微的浑浊；
——2表示严重的浑浊。

目标菌的浊度值应为2，非目标菌的浊度值应为0或1。

4.8.2.4  商品化生化鉴定管的测试方法按试剂说明书进行。

4.8.3  测试结果文件化

所有常规性能测试的数据应按照质量体系的要求填写在培养基内部质量测试记录表里，由资料管理员每季度归档并在有效期内保存。

4.8.4  测试频率

微生物实验室对于购买的每批培养基均应在使用前作质量控制和性能测试，如果不能达到预期目标，则不予使用，由实验室主管将本批培养基退回。

每瓶培养基在使用前也需做质量控制和性能测试，如果不能达到预期目标，则不予使用，重新开启一瓶做质量控制和性能测试，测试合格后方能投入使用。

5. 其他事项

实验室环境、健康和安全：

5.1  配制培养基时应穿实验室工作服，佩戴安全眼镜、一次性头套、无尘手套和口罩。

5.2  移动或拿取高温物品（如从高压灭菌柜内拿出灭菌后的瓶子或容器）时佩戴高温防烫手套，避免被烫伤。

5.3  仔细阅读培养基的MSDS，熟悉培养基有害成分和分类、储存和处理，以及如何处理紧急情况，如急救方法、防火方法等。

6. 附录

6.1  附录1：培养基质量控制标准

6.2  附录2：各培养基配制要求

7. 参考/相关文件

7.1 TC-YQ-M-018  LDZM-80KCS型立式压力蒸汽灭菌器操作规程

7.2 TC-YQ-M-007  电子天平操作规程

7.3 TC-YQ-L-009  Seveny Easy 酸度计操作规程

7.4 GB 4789.28-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求

8. 表格

8.1  TC-GL-05-01 试剂保管帐

8.2  TC-GL-05-02培养基配制记录

8.3  TC-GL-05-03培养基内部质量测试记录表

8.4  TC-GL-05-04 废弃物处置记录