主题：【第七届原创】CNW Athena C18-WP色谱柱测定人工蛹虫草中虫草素和腺苷含量

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发表于：2014/10/31 16:29:56 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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1 前言

蛹虫草也叫北冬虫草，俗名不老草，是虫，菌结合的药用真菌，现代珍稀中草药。北虫草不仅含有丰富的蛋白质和氨基酸，而且含有30多种人体所需的微量元素，是上等的滋补佳品。蛹虫草中富含虫草素和腺苷，对调节人体内分泌和增强免疫功能等显著作用.

腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷是用于合成三磷酸腺苷（ATP）、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。

虫草素是一种天然来源的药物，具有中医医理中冬虫夏草一样的阴阳同补和双向调节人体平衡的功能；它在护肝、保肾、润肺方面由于成分更纯效果更好，而且大补气血，能消除现在不能治愈的痛经、偏头痛、颈椎增生等疾病。从西医医理角度看虫草素具有抗肿瘤、抗衰老、抗菌、抗病毒、免疫调节、改善新陈代谢、清除自由基等多种药理作用，有良好的临床应用前景。

天然虫草资源已日益匮乏，然而蛹虫草更容易人工栽培 , 因此蛹虫草目前被选为冬虫夏草的最佳替代品 , 已进行了规模化的人工栽培和应用现多用人工虫草来满足市场的需求。

注：以上部分内容摘自“百度百科”

本文采用CNW Athena C₁₈-WP色谱柱测定人工蛹虫草中的腺苷和虫草素，并对检测方法进行简单优化，该方法具有简单、快速、重复性好等优点，对人工蛹虫草以及该类保健品的质量控制极为重要。

2 实验方法

2.1 仪器与试剂

Waters e2695液相色谱仪（主要包括2998光电二极管矩阵检测器，柱温箱，自动进样器）；超声波清洗机

实验中乙腈为色谱纯；水为超纯水系统制得， 18MΩ•cm，25 ℃

虫草素和腺苷标准品，美国Sigma公司

2.2 色谱条件

色谱柱：CNW Athena C₁₈-WP(250mm×4.6mm,5μm)；

流动相：乙腈:水=10:90；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL

检测波长：260nm。

2.3 样品预处理

称取粉碎均匀的人工蛹虫草样品0.50g于150mL烧杯中，加入约30mL50℃左右的温水，在50℃下超声提取30min，过滤，收集滤液于100mL容量瓶中。用水将滤纸上的样品小心地转移至烧杯中，再重复提取2次，合并提取液，并用水定容至刻度，冷却至室温。吸取少量提取液，用0.45μm滤膜过滤后进样分析。

2.4 标准溶液的配制

分别准确称取10.0mg腺苷和虫草素标准品，用水配制成浓度为100μg/mL的标准储备液。临用前，再吸取一定体积的上述标准储备液，配成相应浓度的混合标准溶液。

3 结果和讨论

3.1 检测波长的确定

利用2998光电二极管矩阵检测器的3D通道扫描的功能，在200~600nm波长范围内对混合标准溶液进行3D光谱扫描。从图中可以看出，腺苷和虫草素在此波长范围内均有吸收，而且都有两个较强的特征吸收波长。在相应的出峰时间提取光谱，从提取的光谱图中可以看到，腺苷的最大吸收波长为205.3nm，次级吸收波长为259.6nm；虫草素的最大吸收波长为206.5nm，次级吸收波长为259.6nm。对比206nm和260nm吸收波长处的色谱图，当检测波长为206nm时，腺苷和虫草素的响应值最大，然而对样品的检测过程中发现，样品中干扰物质在此波长也有很好的吸收，从而影响腺苷和虫草素的定性和定量分析；当检测波长为260nm时，干扰组分少，定性和定量更为准确，综合考虑，选择260nm为腺苷和虫草素的检测波长。

3.2 流动相条件的优化

流动相中有机相种类和含量对待测组分的分离以及检测时间具有重要的影响。实验中发现，当流动相中乙腈含量为20%时，腺苷和虫草素的出峰时间较早，且未完全分离，不利于样品的检测；当流动相中乙腈含量为10%时，腺苷和虫草素的出峰时间和分离度都比较合适；当流动相中乙腈含量为5%时，虽然腺苷和虫草素也得到了很好的分离，但是大大延长了样品的检测时间，同时响应值也大幅下降，影响待测物质的检出限。结合对样品的检测，最终选择乙腈和水比例为10：90

3.3标准曲线的测定

吸取适量体积上述混合标准溶液，用水稀释配成浓度为4.0、6.0、8.0、10.0、20.0μg/mL的系列混合标准溶液，并按选定的色谱条件进行分析。以样品峰面积Y(mV)对质量浓度X（μg/mL）作图，得到腺苷和虫草素的线性回归方程分别为Y=31803.62X-110.98；Y=32795.58X-2407.8，相关系数R²》0.999，结果表明：腺苷和虫草素含量在4.0~20.0μg/mL之间时，该方法呈现良好的线性关系。

3.4 精密度实验

按照上述色谱方法，对10μg/mL混合标准溶液和样品溶液进行重复测定（n=5），考察方法的精密度，结果表明，采用CNW Athena C₁₈-WP色谱柱测定蛹虫草中的腺苷和虫草素具有较好的精密度，混合标准溶液中和样品的峰面积、峰高和保留时间的相对标准偏差均小于1.

4 小结

（1）本文采用CNW Athena C₁₈-WP色谱柱测定蛹虫草中的腺苷和虫草素，该方法具有简单、快速、重复性好等优点；

（2）为了确保样品中的待测组分能够完全提取出来，可以采用少量多次和延长超声时间的方法进行提取；

（3）流动相中乙腈含量对腺苷和虫草素分离和出峰影响较大，遇到干扰组分，可以通过调节其比列进行进一步分离。

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