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主题：【第七届原创】【许愿原创】高效液相色谱法测定发芽糙米中γ-氨基丁酸含量

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夏天的雪
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发表于：2014/12/26 15:49:39 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
维权声明：本文为bingwang228原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。
                      高效液相色谱法测定发芽糙米中γ-氨基丁酸

    γ-氨基丁酸是一种广泛分布于动植物体内的功能性非蛋白质氨基酸，作为中枢神经系统中重要的异质性神经递质，具有降血压、抗动脉硬化、激活脑内葡萄糖代谢、改善脑机能、促进生长激素分泌等生理功能。近些年，富含γ-氨基丁酸的功能性食品相继被开发并得到了广泛的应用。

  发芽糙米是糙米经浸泡发芽到一定长度，一种由糠层、胚芽及胚乳组成的糙米制品。糙米经发芽后，不仅口感得到改善，而且其营养成分和功能因子大量富积，尤其是γ-氨基丁酸，与未发芽的糙米和精白米相比，其含量大幅增加。

    目前γ-氨基丁酸的分析检测方法有比色法、氨基酸分析仪法、层析法和高效液相色谱法等。本实验以丹磺酰氯为衍生试剂，结合高效液相色谱-二极管矩阵检测器，建立一种能快速、准确测定发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器及设备

Waterse2695液相色谱仪（带有柱温箱和2998二极管矩阵检测器）

pHS-3C型酸度计

恒温水浴锅

超声波清洗机

1.2 试剂

γ-氨基丁酸标准品（纯度≥99%）；

丹磺酰氯；

乙腈；

冰乙酸；

盐酸；

无水碳酸钠；

乙酸钠

1.3 色谱条件

色谱柱：OdyssilC18(250mm×4.6mm, 5μm)；

Cat：OS952505-0

S/N:O9510525BXP0042

流动相：乙腈：50mmol/L乙酸钠溶液（乙酸调节pH值为6.0）=30：70；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：20uL

检测波长：216nm

1.4 样品预处理

    将发芽糙米用粉碎机充分粉碎后过100目筛（过筛率≥90%），然后称取5g发芽糙米样品置于三角烧瓶中，加入50mL水，超声提取30min，冷却至室温。分别加入2mL亚铁氰化钾（质量分数10.6%）和2mL硫酸锌（质量分数30%）溶液，摇匀后用超纯水定容并过滤，滤液备用。

    准确吸取0.5 mL上述滤液到5 mL具塞玻璃试管中，加入0.5mL 碳酸钠（pH9.8），混匀后加入0.5mL丹磺酰氯-乙腈溶液（2g/L），充分混合，45℃水浴避光反应1h（中间摇晃1次），反应完成后加入0.2mL盐酸（1mol/L）中止反应，并用水定容至刻度。取上清液经0.45μm滤膜过滤后进样分析。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

    γ-氨基丁酸对电化学、紫外和可见光吸收小，采用一些常规的直接测定法灵敏度较低，不利于含量的准确测定分析。采用高效液相色谱法对其测定时，通常需要衍生试剂进行衍生，丹磺酰氯是一种常用的氨基酸衍生试剂，它能够与肽的N-端氨基酸反应，生成具有较强紫外吸收的丹磺酰-肽衍生物，从而提高了γ-氨基丁酸在紫外检测器上的灵敏度。反应机理见图1




2.2 检测波长的选择

    利用Waters 2998二极管矩阵检测器在210-400nm波长范围内对衍生后的γ-氨基丁酸标准溶液进行光谱扫描，确认最佳检测波长。γ-氨基丁酸与丹磺酰氯的衍生产物在216nm、247nm和329nm处均有较强吸收。分别在这三个波长处进行色谱图提取，结果表明，在波长216nm处γ-氨基丁酸与丹磺酰氯的衍生产物信号响应值最大，同时在样品的实际检测过程中发现选择216nm为检测波长时，在待测物质附近没有出现干扰物质，因此选择216nm为检测波长。光谱扫描图和不同波长处的色谱图分别见图2、图3.




2.3 标准曲线及检出限

    准确称取10.0mg γ-氨基丁酸标准品于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成浓度为200μg/mL的标准储备液。吸取适量体积标准储备液，经丹磺酰氯衍生，配成一系列浓度的γ-氨基丁酸标准溶液。以样品峰面积Y(mV)对质量浓度X（μg/mL）作图，得到线性回归方程Y=138705X+22060，相关系数R2=0.99993，结果表明：γ-氨基丁酸含量在该浓度范围内呈现良好的线性关系。见图4



2.4 回收率与精密度

    称取5g经过粉碎、过筛后的发芽糙米样品两份，往其中一份样品中加入10mL标准储备液（200μg/mL），另一份作为对照样品，然后按照上述前处理方法进行处理并测定含量。分别对标准溶液、对照样品和加标样品进行重复测定（n=6），考察方法的回收率和精密度。实验结果表明，该方法具有较好的回收率和精密度，发芽糙米中γ-氨基丁酸的回收率大于95%，对照样品、加标样品峰面积的相对标准偏差（RSD%）分别为0.53和0.41。标准品色谱图和发芽糙米样品色谱图分别见图5和图6




3 小结

（1）本实验方法主要依据GB5413.26-2010第二法对样品进行提取和衍生，发芽糙米中γ-氨基丁酸测定已有文献报道，但是流动相的选择以及洗脱程序都较为复杂，本实验结合样品较为干净、待测组分单一、干扰物较少的特点，采用等度洗脱的方法，建立了一种快速、准确测定发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的分析方法。（2）在实际检测过程中发现，精白米、茶叶和一些粮食酿造食品中也存在γ-氨基丁酸，但是与发芽糙米相比，含量较低，而且发芽糙米中γ-氨基丁酸的含量受到原料品种、产地以及工艺等因素的影响。
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跟牛磺酸一样的处理 一样的条件就能出来
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跟牛磺酸一样的处理 一样的条件就能出来
是的，方法差不多
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