主题：【已应助】毛细管等电聚焦

ITP是引入前导和尾随电解质并将样品夹在这两种电解质中间以达到富集的目的，这个分离模式没有pH梯度的。而在IEF中，封堵剂可加可不加，不加的话跟CZE很相似。

我见过的样品是与两性电解质混合后再进样的。为了保持整个体系液体的一致性，与电解质混合进样才合理……

好多问题，我答不完了，坐等别的大神来补充吧~

学习了！

1。 封端剂建议要加上，特别是精氨酸，目的是为了把全pH的梯度都堵在窗口之前的位置，否则会有物质聚焦在窗口之后，这样的话你就不能检测到它。
2。样品是和两性电解质+marker+cIEF Gel（with Urea）一起进样的，通常是要充满整个毛细管的。
3。很多参数，包括聚焦时间，封端剂的量，聚焦电压等等，都是可以优化的，最基本参数的是参见Beckman 的cIEF protocol。
4。最后的迁移是采用电压迁移的，比气压分离的分辨率高。

原文由 CEcret(v2812644) 发表:
1。 封端剂建议要加上，特别是精氨酸，目的是为了把全pH的梯度都堵在窗口之前的位置，否则会有物质聚焦在窗口之后，这样的话你就不能检测到它。
2。样品是和两性电解质+marker+cIEF Gel（with Urea）一起进样的，通常是要充满整个毛细管的。
3。很多参数，包括聚焦时间，封端剂的量，聚焦电压等等，都是可以优化的，最基本参数的是参见Beckman 的cIEF protocol。

4。最后的迁移是采用电压迁移的，比气压分离的分辨率高。

1.虽然你说的有道理，我们有试过不加封堵剂做出来marker的相对位置是没有差别的，不知道您有没有试过？也因此有此疑问。

2.加尿素的功能是什么？

3.聚焦的时间优化成什么样叫做好？怎么确定封堵剂的量是合适的？

4. 既然是电压迁移，那么和聚焦过程的差别在哪里呢？

原文由 nini2006(nini2006) 发表:
ITP是引入前导和尾随电解质并将样品夹在这两种电解质中间以达到富集的目的，这个分离模式没有pH梯度的。而在IEF中，封堵剂可加可不加，不加的话跟CZE很相似。

我见过的样品是与两性电解质混合后再进样的。为了保持整个体系液体的一致性，与电解质混合进样才合理……

好多问题，我答不完了，坐等别的大神来补充吧~

ITP的过程达到稳定以后每个区段的焦耳热、pH值都是有差别的，如果把这样的区段无限细分，不就是pH梯度吗？等电聚焦的时候两性电解质充满管，阳极端和阴极端分别是磷酸和NaOH溶液，不是类似于前导电解质、尾随电解质吗？要是这样的话，也就是说，在电场的推动下，这种状态是可以保持稳定的；一种由有限个pH值依次排列形成的pH区段是可以实现的；过度聚焦是可以在继续维持电压的情况下避免的……

原文由 nini2006(nini2006) 发表:
ITP是引入前导和尾随电解质并将样品夹在这两种电解质中间以达到富集的目的，这个分离模式没有pH梯度的。而在IEF中，封堵剂可加可不加，不加的话跟CZE很相似。

我见过的样品是与两性电解质混合后再进样的。为了保持整个体系液体的一致性，与电解质混合进样才合理……

好多问题，我答不完了，坐等别的大神来补充吧~

十分感谢nini姐奖励……

原文由 wy20071722(wy20071722) 发表:

原文由 nini2006(nini2006) 发表:
ITP是引入前导和尾随电解质并将样品夹在这两种电解质中间以达到富集的目的，这个分离模式没有pH梯度的。而在IEF中，封堵剂可加可不加，不加的话跟CZE很相似。

我见过的样品是与两性电解质混合后再进样的。为了保持整个体系液体的一致性，与电解质混合进样才合理……

好多问题，我答不完了，坐等别的大神来补充吧~

十分感谢nini姐奖励……

你勤快点，还会继续奖的！

原文由 wy20071722(wy20071722) 发表:

原文由 CEcret(v2812644) 发表:
1。 封端剂建议要加上，特别是精氨酸，目的是为了把全pH的梯度都堵在窗口之前的位置，否则会有物质聚焦在窗口之后，这样的话你就不能检测到它。
2。样品是和两性电解质+marker+cIEF Gel（with Urea）一起进样的，通常是要充满整个毛细管的。
3。很多参数，包括聚焦时间，封端剂的量，聚焦电压等等，都是可以优化的，最基本参数的是参见Beckman 的cIEF protocol。

4。最后的迁移是采用电压迁移的，比气压分离的分辨率高。

1.虽然你说的有道理，我们有试过不加封堵剂做出来marker的相对位置是没有差别的，不知道您有没有试过？也因此有此疑问。

2.加尿素的功能是什么？

3.聚焦的时间优化成什么样叫做好？怎么确定封堵剂的量是合适的？

4. 既然是电压迁移，那么和聚焦过程的差别在哪里呢？

没用CE分离过蛋白质，对以下说法不敢打包票100%正确：2、 我用别的方法分离分析蛋白质时，尿素的加入是为了使蛋白质变性成一维结构，释放出结构信息。4、一步法中，聚焦和迁移是同时进行，没区别。两步法中，聚焦时的电解液和迁移时的电解液是不同的，另外电压和时间也有不同，一般情况下前者电压较低时间较短。

原文由 wy20071722(wy20071722) 发表:

原文由 nini2006(nini2006) 发表:
ITP是引入前导和尾随电解质并将样品夹在这两种电解质中间以达到富集的目的，这个分离模式没有pH梯度的。而在IEF中，封堵剂可加可不加，不加的话跟CZE很相似。

我见过的样品是与两性电解质混合后再进样的。为了保持整个体系液体的一致性，与电解质混合进样才合理……

好多问题，我答不完了，坐等别的大神来补充吧~

ITP的过程达到稳定以后每个区段的焦耳热、pH值都是有差别的，如果把这样的区段无限细分，不就是pH梯度吗？等电聚焦的时候两性电解质充满管，阳极端和阴极端分别是磷酸和NaOH溶液，不是类似于前导电解质、尾随电解质吗？要是这样的话，也就是说，在电场的推动下，这种状态是可以保持稳定的；一种由有限个pH值依次排列形成的pH区段是可以实现的；过度聚焦是可以在继续维持电压的情况下避免的……

你这样理解似乎也行得通，只是ITP中毛细管两端的pH差异不如IEF中的大。

原文由 nini2006(nini2006) 发表:

原文由 wy20071722(wy20071722) 发表:

原文由 nini2006(nini2006) 发表:
ITP是引入前导和尾随电解质并将样品夹在这两种电解质中间以达到富集的目的，这个分离模式没有pH梯度的。而在IEF中，封堵剂可加可不加，不加的话跟CZE很相似。

我见过的样品是与两性电解质混合后再进样的。为了保持整个体系液体的一致性，与电解质混合进样才合理……

好多问题，我答不完了，坐等别的大神来补充吧~

ITP的过程达到稳定以后每个区段的焦耳热、pH值都是有差别的，如果把这样的区段无限细分，不就是pH梯度吗？等电聚焦的时候两性电解质充满管，阳极端和阴极端分别是磷酸和NaOH溶液，不是类似于前导电解质、尾随电解质吗？要是这样的话，也就是说，在电场的推动下，这种状态是可以保持稳定的；一种由有限个pH值依次排列形成的pH区段是可以实现的；过度聚焦是可以在继续维持电压的情况下避免的……

你这样理解似乎也行得通，只是ITP中毛细管两端的pH差异不如IEF中的大。

这里会提出这个问题的最关键的一点就是：在H+参与平衡的ITP中，它们的pH是有差别的，只是这种差别是几个梯度而已。而形成多少个梯度，实际上与样品是密切相关的，少数的样品组成形成少数的梯度，多数的样品组成形成多数的梯度，就跟微分一样，把这个梯度无限细分下去，就是连续的pH梯度。两性电解质是许多含有不同等电点的多肽的混合物。而我们所测定的样品与两性电解质混合在一起，行为应与两性电解质差不多，只是我们要观察它，它才是样品，要是不是观察它，它和两性电解质的区分就不大了（当然，紫外吸收还是有差别的）。

那么，在等电聚焦的过程中，pH梯度形成的原本的解释是什么呢？在陈义的书中有说明。晕，现在那本书找不到了，这里就不能引用出来了。大概意思是由于磷酸和NaOH的存在，形成pH梯度，而两性电解质移动到各自等电点的位置，样品移动到等电点的位置，移动推出。这里的问题来了，pH梯度是先于两性电解质移动形成，还是同时或是在两性电解质移动之后呢？要是先于两性电解质移动形成，那么两性电解质的作用为何？在这种情况下，就是说去掉两性电解质的存在，这个pH梯度已经形成了？维持电压，这个pH梯度还能维持吗？没有了两性电解质，单是有样品，还能做聚焦吗（还能对样品进行聚焦）？我们可以确定的是，当停止聚焦的时候，两性电解质停止移动，pH梯度形成。这里我倾向于认为pH梯度的形成与两性电解质的移动关系是“边移动，边形成”，它们是同一事件的不同角度的特征。而形成这个pH梯度的过程就是类似与ITP的稳态形成过程。这里的两性电解质必不可少，它的作用就好像是ITP中的样品，无限多的样品组成形成了连续的pH梯度，导致等电聚焦的发生（混在其中的样品也是一种两性电解质的存在）。在这里面，形成的ITP的区带无限小，看起来就好像一个点，样品被聚焦。

这个过程我也没有真正实验过，只是当初看到的时候这么想了，我什么都不会，只会胡思乱想，诶！不知道大家是否觉得这么想是否有道理。