接下来,由我来对《将ADME色谱柱作为第二选择的提案》进行说明。
在进入正题之前,我想向大家介绍一下键合了金刚烷基团色谱柱的开发背景。
在大家的手边,除了C18色谱柱以外,应该还有其他键合不同官能团的色谱柱。为了能保留住极性化合物,可能会使用高极性色谱柱和接近100%水相的流动相,以达到对极性化合物的保留和分离。
我们制作了能反映色谱柱特长的表面极性和疏水性的参数图谱。
根据参数图谱我们可以看到目前的色谱柱所不具备的特殊的位置(尽可能靠上、靠右),如果创造出了这样的填料,就可以完成至今为止达不到的分析了。现在诞生的就是一款导入了金刚烷基团的ADME色谱柱。ADME色谱柱可以在反相模式进行分析,而且具有其他色谱柱所不具备的特殊极性和疏水性,可以提供新颖独特的分析。
如果您的实验遇到了瓶颈,想要放弃C18色谱柱和反相色谱条件的话……
就请您尝试一下ADME色谱柱吧!
我们一直在强调CAPCELLPAK ADME色谱柱对于极性化合物具有特殊的保留行为,在实际分析中对于大家来说也是手头必备的一款色谱柱。
一般来说,进行分析实验时的第一选择是C18色谱柱。这时,如果保留和分离没有问题的话,就会继续这样使用C18色谱柱进行分析。但是,在保留弱和分离度不足的情况下,也会在使用C18色谱柱的基础上变更流动相条件,或者更换色谱柱并且调整流动相条件。
这种情况下,大部分人会使用流动相选择范围较广的高极性C18色谱柱,以便能在100%水相的流动相条件下进行分析。
请看常规C18色谱柱的分析例。10mmol/L 甲酸铵/乙腈=80/20的流动相条件下,样品为大家所熟知的极性化合物——酰胺类化合物、黄嘌呤诱导体、硫酸结合体和羟基类化合物,先使用C18色谱柱进行分析,未取得良好分离。
这种情况下,虽然也可以增加流动相中的水相比例来实现分离,但是这样整体分析时间增加,降低分析效率。
为避免分析时间的增加,并使流动相的选择范围更广,在这里我们使用了可以在100%水相条件下使用的高极性C18色谱柱。这个例子是使用其他公司强极性C18色谱柱的分析结果,但是分离反而变得更差了。
第一选择虽然是C18色谱柱,但是在C18色谱柱保留、分离效果不好的情况下,不改变原有流动相,请使用ADME色谱柱进行分析吧!
为什么推荐使用ADME色谱柱分析呢?
刚才在介绍金刚烷的时候提到过,ADME色谱柱可以在反相模式下进行分析,并且具有其他色谱柱所不具备的特殊高表面极性和疏水性,可以用于尝试分析目前已有的色谱柱所不能实现的分析。
在原流动相条件下,将色谱柱更换为CAPCELLPAK ADME色谱柱。
刚才,使用其他公司的高极性C18色谱柱未达成分离,而改变流动相条件后使得分析时间延长了3倍,并且峰强也变弱了。
但是,在相同流动相条件下,将色谱柱变更为CAPCELL PAK ADME后,如图所示,只需要10分钟就能达成良好分离。
这是因为,在刚才的参数图中可以看出,CAPCELL PAK ADME色谱柱具有其他色谱柱所不具备的与样品之间的特异的相互作用。在第一选择色谱柱未能取得分离的情况下,在原有流动相条件下,请使用CAPCELLPAK ADME色谱柱进行尝试!
刚才我们看了表面极性与疏水性的参数图,那么接下来让我们看看能显示填料性能的10种标准物质的检测色谱图吧!
虽然本公司的填料证明书里已经有相关的应用数据资料,作为评价各种色谱柱的方法,我们使用这10种样品及如下色谱条件,对色谱柱填料进行了评价。
其他公司色谱柱也使用同样方法进行评价。
实际得到的结果请参考幻灯片上的色谱图。
10种标准物质中,具有特征性出峰行为的物质是苯甲酸甲酯和苯。
使用常规色谱柱分析时,出峰顺序为苯甲酸甲酯在前,苯在后;而CAPCELL PAK ADME S3色谱柱,由于苯甲酸甲酯具有极性部位,因此保留较强。
于是,使用CAPCELL PAK ADME S3色谱柱分析时,苯出峰在前,苯甲酸甲酯出峰在后,和常规色谱柱有所不同。
关于这一点,我也将进行详细说明。
我们从刚才的色谱图以及各种参数,可以计算出色谱柱的疏水性和表面极性。
疏水性是由苯和甲苯的分离系数计算得出,表面极性是由甲苯和苯甲酸甲酯的分离系数计算得出。
在这里,用CAPCELL PAK C18 MGII色谱柱的参数进行比较。MGII色谱柱的疏水性是2.10,CAPCELL PAK ADME色谱柱为1.90。
MGII色谱柱的表面极性是0.43,CAPCELL PAK ADME色谱柱为0.75。
数值越高,则具有更高的识别能力,色谱峰的分离程度越高。
让我们再看一下参数图。
CAPCELL PAK ADME色谱柱的坐标点在这里。
它处于和其他类型的色谱柱所不同的位置,和其他反相色谱柱进行比较,会发现它的分析范围更广,擅长分析极性化合物。
请再看一下实际得到的色谱图。
具有其他类型色谱柱所不具备的特殊的表面极性和疏水性的CAPCELL PAK ADME S3色谱柱,对于高极性化合物1-4的保留比常规C18色谱柱强,而且ADME色谱柱所得到的萘的色谱峰与其他类型的色谱柱保留时间相近。这表示CAPCELL PAK ADME色谱柱既能保留疏水性化合物,也能保留极性化合物。这是因为官能团的差异(笼状的金刚烷基和直链的十八烷基)所带来的影响。
最后介绍一下ADME色谱柱的应用数据。
那么,这张参数图我们今天见到几次了?这是第三次。
将ADME色谱柱与常规C18色谱柱进行比较的同时,为大家介绍应用数据。
在C18色谱柱不能取得保留和分离的情况下,可以使用相同的流动相条件,将ADME色谱柱作为第二选择进行分析。
在介绍ADME色谱柱的应用数据之前,让我先介绍一下使用PC HILIC色谱柱进行分析的应用数据。
核苷是由碱基和糖(核糖)形成的极性物质,因此可以使用HILIC模式进行分析。
对于生物样品中的极性化合物进行分析时,有以下几点需要注意。
极性化合物在反相模式下会较早溶出,所以不会有问题;但是在HILIC模式下,因为溶出较慢,因此不知道分析时间设定为多少合适。
因此,极性化合物在反相模式下进行分析比较好。
以下为ADME色谱柱对核苷类化合物进行分析的应用数据。
比较了CAPCELL PAK ADME、CAPCELLCORE ADME和常规C18色谱柱,可以观察到CAPCELL PAK ADME和CAPCELLCORE ADME色谱柱的特长。
首先,对于高极性的核苷进行分析,得到如下色谱图。
使用CAPCELL PAK ADME S5色谱柱进行分析,使高极性的核苷得到了充分的保留与分离。
而且分析时间可以控制的很精确。
接下来是鸟嘌呤核苷和2’-脱氧鸟苷的分析例子。
首先,使用常规C18色谱柱分析时,在死时间附近得到了保留和基线分离,但是由于保留较弱,在死时间附近会和杂质峰一起溶出、导致杂质峰和样品峰发生重叠。
而使用ADME色谱柱分析,由于它具有其他类型色谱柱所不具备的特异性相互作用,也就是发挥了羟基的识别能力(请回忆一下那张参数图),因此保留增强,同时分离度也提高了。
接下来是胞嘧啶核苷和2’-脱氧鸟苷的分析例。
胞嘧啶核苷在核苷类化合物中属于极性非常高的化合物。首先使用乙腈作为有机相,用常规C18色谱柱进行分析,没有实现分离。
之前也介绍过了,在相同流动相条件下,把常规C18色谱柱更换为ADME色谱柱,就可以像这样增强保留,提高分离度。
紧接着,将有机相变更为甲醇后,可以进一步增强保留,分离度也从3.59提高了2倍,变为7.28。
这可能跟甲醇是质子性溶剂而乙腈是非质子性溶剂有关。
对比常规C18色谱柱的出峰行为,虽然改变有机相后分离度也提高了,但是远不及ADME的效果好。
接下来是使用CAPCELL CORE系列色谱柱,对酪蛋白的胰蛋白酶水解产物的分析例。
CAPCELL CORE C18 S2.7和CAPCELL CORE MP S2.7两款色谱柱的保留行为基本相同,但是使用CAPCELL CORE ADME S2.7色谱柱分析时体现出了ADME的特长,分析范围更加广泛。
和上一张幻灯片相关,这是顾客反映的使用CAPCELL CORE ADME和CAPCELL CORE C18 S2.7两款色谱柱,对高亲水性的四肽和五肽进行分析的例子。
四肽具有细胞吸附性蛋白质所共有的细胞吸附活性配列(Arg-Gly-Asp)。(2013年进行了将具有细胞吸附活性的肽类化合物编入抗癌药物的研究。)
因此,这一类肽类化合物的分析变得尤为重要。
使用CAPCELL CORE ADMES2.7色谱柱进行分析,也发挥了ADME的特长,增强了保留与分离。
ADME色谱柱具有其他类型的色谱柱所不具备的表面极性和疏水性,因此对极性高的小分子肽类物质能进行有效的保留与分离。
接下来是有机酸的应用数据。
一般这样的有机酸(在这里分析二元羧酸)的极性很高,保留很困难。
在此对马来酸和富马酸进行分析。马来酸是富马酸的异构体,马来酸是顺式结构,富马酸是反式结构。
另外,他们的pKa值也不同,因此流动相的pH也会影响他们的出峰行为。
而且,马来酸有在分子内形成氢键的倾向,这也对它的保留造成影响。
使用CAPCELL PAK ADME S5色谱柱、在乙腈系统下,将流动相pH调整为3,对马来酸和富马酸进行分析。
结果如图所示,未取得分离。于是将有机相更换为甲醇。
将流动相调整为甲醇后,使用常规C18色谱柱分析依然未达成分离,但是使用CAPCELL PAK ADME S5色谱柱,则保留增强,且达到良好分离。
(对于这样的异构体,使用CAPCELL PAK ADME是否能达到有效分离,我们将对此进行数据的积累,继续研究。)
使用CAPCELL PAK ADME S3色谱柱和常规C18色谱柱对实际样品(尿、营养剂和天然物质)进行分析。
使用如下色谱条件,使用梯度洗脱进行比较分析。
首先是尿的分析。尿中含有很多极性化合物。
将CAPCELL PAK ADME S3色谱柱和常规C18色谱柱进行比较,整体保留增强,分离效果更好。可以看出CAPCELL PAK ADME S3色谱柱可以从极性化合物到疏水性化合物有一个范围广泛的分析能力。
接下来是对营养剂的分析。
使用常规C18色谱柱分析,随着流动相的初始有机溶剂的减少,有分离变好的趋势,但是分析时间也延长了。
另一方面,使用CAPCELL PAK ADME S3色谱柱,随着有机溶剂的初期浓度的增加,极性不同的几个物质均得到了良好保留,与杂质峰得到了良好分离,并且分析时间也缩短了。
这个分析例中,CAPCELL PAK ADME S3色谱柱和常规C18色谱柱的出峰行为的不同,也是由于CAPCELL PAK ADME S3色谱柱具有其他类型色谱柱所不具备的特殊表面极性和疏水性,因此即使增加了流动相的初期浓度,也能对极性化合物进行充分的保留和分离。
天然物质的成分往往比较复杂且未知,因此使用从极性物质到疏水性物质都有良好保留的CAPCELL PAK ADME来增加保留非常有效。