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主题：【分享】（续）色谱百问百答，掌握这些你就成高级工程师了----(10)

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发表于：2015/03/06 16:02:08 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
  • 91、流动相中加入四氢呋喃对柱子有损害吗?我现在分析一样品流动相中用到20%的四氢呋喃才能把峰分到基线。但柱子只能用一个星期分离效果就不好了。请问是四氢呋喃损坏了柱子吗?
    　　答：    四氢呋喃(THF)是反相色谱中洗脱能力极强的溶剂，比甲醇和乙腈都强很多。在流动相中加入THF能改善某些难分离的物质对的分离度。但THF不稳定，容易降解生成具有很强反应活性的过氧化物，能与分析物反应生成新化合物，导致拖尾、峰分裂和鬼峰产生。高反应活性的过氧化物还可以和填料固定相发生化学作用，THF对柱子有损伤这点是无疑的，而且这种损伤是随时间累积的。THF保质期一般规定是6个月，放得越久，里面产生的过氧化物含量越大，你应该避免使用生产日期已很久的THF溶剂，而且最好将THF冷藏、干燥和避光保存，使用前最好能检测一下过氧化物的含量。
    　　92、在用液相色谱同时分离多种组分时，怎么通过条件色谱条件使各个峰达到比较理想的分离效果!
    　　答：    这是方法开发的大问题。方法开发建立，要做的就是：针对分析物和基体的情况不同，选择色谱柱类型和分析条件，包括流动相溶剂类型、组成比例、pH值、温度和流速等参数的确定。
    　　93、样品过载问题，按药典检测方法检验一些药品有关物质时，都要注入高浓度的供试液，这样往往使得柱过载而峰变形，按老师的方法减小浓度和注入量均是不允许的，怎么处理这问题?
    　　答：    药典方法中注入高浓度供试液测定有关物质，提高注入浓度是为了把杂质峰的信号增强。有时候为了把杂质峰显现出来，主峰因过载有所变形，如在允许范围内，也能接受。但前提是杂质峰和样品主峰分开，如果因过载而使两峰没有得到需要的分离度，杂质峰信号再强也失去了意义。我认为药典规定的条件是允许在一定范围内进行调节的，因为药典没有规定具体使用色谱柱的品牌，而不同品牌的柱子，上样量是有差异的。对色谱条件微调，并取得到了很好的分析结果，如果规定不允许，那你首先要怀疑这个规定是否合理，或者是否对规定的理解有问题。
    　　94、哪些原因会造成色谱峰变宽、峰高变低，有哪些解决办法?
    　　答：    确实是这样，如果其它色谱条件没有改变，柱效下降是导致峰变宽的主要原因。对于易电离的极性物质，如果流动相pH选择不合适，分析物既有中性分子态存在，又有离子态存在，峰也会变宽变矮。色谱柱使用后柱效逐步下降是正常现象，如突然降低则属异常。柱效下降原因有很多，但柱效快速下降则多半是使用不当，造成填料特性或柱床结构改变所致。如超过使用pH范围造成的固定相和硅胶基体的流失、柱床塌陷等;还有强保留物质吸附在填料表面，形成非特异性吸附层，完全改变了原有固定相的表面活性和分离性能，使柱效下降;另外进样时的压力脉冲，也会破坏柱床结构影响柱效。
    　　95、我以前做苏丹红用的是安捷伦的SB-C18柱，峰形什么都很好，最近发现4个标样峰后都带有一个小峰，一开始以为是标样问题，后来换XDB-C18后标样又正常了。可是用SB-C18柱做其他用正常，不知怎么回事?还有，像这种C18柱如果压力过高能不能反冲，该如何冲洗?一般做兽残、农残什么的，而且感觉三聚氰胺做后压力更易增高，且容易引发进样器漏等问题，请问做完三聚氰胺需对系统做特殊清洗吗?
    　　答：    用SB柱，标样后带一小峰，而且是只对苏丹红标样测定时有，估计和苏丹红标样的测定方法和其它样品测定方法不同有关。最好能把谱图贴上来看看，是什么样的小峰?才能判断是溶剂峰还是杂质峰。XDB柱和SB柱是有区别的，XDB键合度高，封尾良好，反相保留能力强;而SB柱，未进行封尾，对极性物质选择性好。有可能你的苏丹红标样分解了，有极性杂质生成，SB柱能把杂质分开，而XDB柱不能。这两款柱子压力大了，可以反冲。有正常维护时的反冲冲洗和再生时的强溶剂冲洗两种，冲洗方法在在线讲座里也写了，你再回到本贴的前面看看就可以了。三聚氰胺和三乙胺类似，本身容易和硅醇基作用而吸附在填料表面，另外三聚氰胺测定的样品基体含蛋白类的强保留物质较多，容易污染色谱柱柱头引起填料间隙堵塞柱压升高，最好每次做完样后，都用甲醇或乙腈反向清洗维护一下。如有蛋白类的污染，也定时用本讲座中提到的清洗方法做一下维护。
    　　96、我是做农药残留分析的，不同的基质杂质含海量是不同的，我用C18分析时有可能一次就污染了，我用高流速，和反向冲洗都解决不了，是不是这根柱子就废了，有没有其他的办法?
    　　答：    高流速反向冲洗是对的，关键你用了什么溶剂冲洗呢?用原来的流动相冲洗肯定不管用，要不然就不会累积在柱子上了。你应该用流动相中的强溶剂B冲洗，如果不行，就需要启用再生的程序，当然再生时用的溶剂更强。100%甲醇---100%乙晴---75%乙晴/25%异丙醇---100%异丙醇---100%二氯甲烷---100%正己烷用每种溶剂冲洗至少10个柱体积，对于250mm×4.6mm的分析柱，合适的冲洗流速是1～2ml/min。最后用10柱体积的异丙醇过渡，然后回到原来的流动相体系。再生还不解决问题，最后一招就是挖补柱头填料，把柱头污染的填料挖掉，用干净填料填补进去。挖补填料，破坏原有柱床结构，挖补后柱效也不可能有新柱水平，或许能再维持一段时间，但不会长久。
    　　97、还有溶剂中的金属过滤头生锈了，会有什么影响?会不会影响到柱子的寿命，金属离子和柱子有没有什么反应?
    　　答：    我觉得你就把锈当成颗粒物污染的一种，会导致拖尾、柱压上升等。溶解的金属离子一般在反相柱上没有什么保留能力，马上就会被冲出柱子，不会和固定相或者和硅胶基质反应。
    　　98、保护柱和预柱的作用是不是一样的，如果不一样有什么区别么?保留时间漂移多少为可以接受的范围?
    　　答：    保护柱一般带填料，相当于一根缩短了的色谱柱(一般是1-2cm长度)，卡套里可更换的柱芯，柱管、筛板和填料都有。保护柱里的柱芯好像是在前面开路的扫雷部队，流动相和样品里如有什么损害柱子的污染物，保护柱就自己承受了下来。而预柱，现在一般指的就是接在进样器和色谱柱之前的在线过滤器。在线过滤器和保护柱的最大区别是不带填料，只有可更换的筛板。预柱只能保护色谱柱免受颗粒物质的污染，而不能阻挡溶解在流动相中的强保留物质。保留时间是液相色谱中一个很有用的诊断分离问题的工具。保留时间受流动相组成、温度、pH、流速、固定相流失和柱老化等很多因素的影响，如果所有这些参数保持不变，保留时间也保持恒定。但在实际操作中，不可能对每个色谱参数进行很完美的控制，如即便加了柱温箱，温度还是会有波动;流动相组成会因组分挥发性不同而改变。所以保留时间有上下0.02-0.05min的变动是非常正常的，对某些方法有0.1min上下变动也属正常。保留时间有大的变化，预示着系统和方法存在问题。流路里有气泡存在，泵阀有泄漏，会因流量降低而导致保留时间增加。梯度混合比例阀故障也是保留时间变化原因之一。
    　　99、随着进样室温度升高，对分析物分解有影响吗?
    　　答：    如果化合物热稳定性差，分析物分解可能会带来一些问题。这在制药工业中比较常见。如果药物或中间体热分解温度低于进样口温度，则分析结果中将出现特殊的峰或与目标分析物发生反应。
    　　100、四氢呋喃对柱子有损伤吗?我有一流动相四氢呋喃要用20%才能使峰分离到基线。可是每根柱子只用一个星期后分离效果就不好了，请问是四氢呋喃的原因吗?
    　　答：    四氢呋喃(THF)是反相色谱中洗脱能力极强的溶剂，比甲醇和乙腈都强很多。在流动相中加入THF能改善某些难分离的物质对的分离度。但THF不稳定，容易降解生成具有很强反应活性的过氧化物，能与分析物反应生成新化合物，导致拖尾、峰分裂和鬼峰产生。高反应活性的过氧化物还可以和填料固定相发生化学作用，THF对柱子有损伤这点是无疑的，而且这种损伤是随时间累积的。THF保质期一般规定是6个月，放得越久，里面产生的过氧化物含量越大，你应该避免使用生产日期已很久的THF溶剂，而且最好将THF冷藏、干燥和避光保存，使用前最好能检测一下过氧化物的含量。
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2015/3/6 17:08:19 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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2015/3/8 11:22:12 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
不错，谢谢分享。
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