主题：【第八届原创】固相萃取-气相色谱-质谱联用法检测植物油中2-十二烷基环丁酮和2-十四烷基环丁酮

        摘  要：建立固相萃取-气相色谱- 质谱联用(solid phase extraction with gas chromatography-mass spectrometry，SPE-GC-MS)法测定植物油中2-十二烷基环丁酮和2-十四烷基环丁酮。对影响分析物萃取效率的诸因素如洗脱溶剂等进行详细考察和优化。最佳萃取条件为0.5 g样品与5 mL乙腈混匀，经ProElut Silica （500 mg/3mL）固相萃取柱净化后，以GC-MS 进行测定，该方法对2-十二烷基环丁酮和2-十四烷基环丁酮的检出限为10μg/kg，线性范围为0.01～0.5μg/mL，线性相关系数分别为0.99938和0.99977，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)(n=3)小于6%。该方法成功应用于植物油中2-十二烷基环丁酮和2-十四烷基环丁酮的分析，加标回收的回收率为78%～91%。
关键词：固相萃取；气相色谱-质谱；2-十二烷基环丁酮；2-十四烷基环丁酮；植物油

        食品辐照作为对物质或食品进行加工处理的新型保藏技术，在国际上已逐渐被认可，但是在商业化应用、国际贸易以及辐照食品的市场监管方面，迫切需要有辐照食品鉴定检测方法。

    经辐照后，在含脂食品中会产生特异性辐解产物2-烷基环丁酮(2-Alkylcyclobutanones ，2-ACBs)，它是含脂辐照食品的特异性辐解产物，在未辐照的含脂食品中，至今还从未检测到此类化合物。在1990年， 2-ACBs 类化合物可作为检测含脂辐照食品的标志性化合物, 首次被报道，随后依据该结论制定了欧盟标准EN1785和GB\T 21926-2008 。2-ACBs由食品中的游离脂肪酸或甘油三酸酯的羰基氧失去一个电子,再经由重排过程生成，其过程如图1所示。

图1  经辐照后游离的脂肪酸转化为2-ACBs的示意图

        在大多数食品中，棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸是主要的脂肪酸，而棕榈酸和硬脂酸是其中含量最高的饱和脂肪酸，其辐解物2-十二烷基环丁酮（2-dodecylcyclobutanone，2-DCB）和2-十四烷基环丁酮（2-tetradecylcyclobutanone，2-TCB）相对于其它2-ACBs较为稳定，因此一般作为检测含脂辐照食品的主要标志性化合物。目前对含脂辐照食品大多采用佛罗里硅土柱进行净化，但是该法的应用范围有限。本实验拟通过优化固相萃取（solidphase extraction，SPE）条件，采用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-massspectrometry，GC-MS)技术测定植物油中2-十二烷基环丁酮和2-十四烷基环丁酮，为进一步缩短2-ACBs 萃取和分离时间、减少溶剂使用量、提高检测灵敏度以及扩大方法应用范围提供基础数据和理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
GCMS-QP2010 气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；DM-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）迪马公司；XH-C 涡旋混合器 江苏金坛市盛威实验仪器；80-1 高速离心机 河南省予华仪器；OSB-2100 旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；12孔固相萃取装置 迪马公司； ProElut Silica（500 mg/3mL）固相萃取柱 迪马公司。HSC-12B 氮吹仪天津市威仪科技发展有限公司；
丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯乙腈、甲基叔丁基醚、正己烷（均为色谱纯）迪马公司。
实验所用的植物油均购自当地市场。

1.2 方法
1.2.1 标准贮备液的制备
称取一定量标准品，溶于正己烷溶剂中，配制成浓度为0.5 mg/mL的标准贮备液。再配制成质量浓度系列为0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL的标准工作溶液，备用。

1.2.2 仪器分析条件
气相色谱条件：色谱柱为DM-5MS (30.0m×250μm，0.25μm)；载气He(99.995%)；恒流，柱流速1.0mL/min；不分流，进样量1μL，进样口温度为260℃；起始温度80℃(保持1min)，以15℃/min的速度升至150℃，再以8℃/min升温至200℃，再以20℃/min升温至260℃(保持5min)。
质谱条件：EI源，离子源200℃，溶剂延迟为3min，选择离子监测模式（SIM），选择监测离子（m/z）：69、84、98、112、125。

1.2.3 样品的提取
称取0.5 g样品于10 mL带塞试管中，加入5 mL乙腈，涡旋混合2 min，超声提取2 min，4000 rpm下离心2min，取上清液；下层油脂再用5 mL乙腈重复上述步骤，合并两次上清液。将得到的上清液在50℃下，氮吹近干，再慢慢挥干，再向氮吹瓶中加入2.5 mL正己烷复溶，待净化。

1.2.4 样品的净化
依次用5 mL甲基叔丁基醚，5mL正己烷缓慢通过ProElut Silica固相萃取柱，以达到润湿小柱，活化填料，除去干扰杂质的目的；再将1.2.3节方法制得的待净化液转移到ProElut Silica固相萃取柱中，流出液弃去；然后用5 mL正己烷淋洗，弃去流出液；再用10 mL甲基叔丁基醚：正己烷(1：99V:V)洗脱，用旋转蒸发瓶接收，直至洗脱液完全自然滴出。在50 ℃下，将收集到的洗脱液氮吹浓缩，然后用正己烷定容至1 mL后供GC-MS分析。

2 结果与分析
在固相萃取操作中，影响分析物峰面积的主要固相萃取因素有洗脱剂、洗脱体积、洗脱速率和上样速率。为了获得最佳分析结果，需要对其进行优化。

2.1固相萃取条件的确定

2.1.1 提取溶剂的选择

2-十二烷基环丁酮（2-DCB）和2-十四烷基环丁酮（2-TCB）与脂肪酸的结构及其类似，故能溶于极性和中等极性的试剂中。分别用丙酮、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯作为2-DCB 和2-TCB的提取溶剂。实验结果表明乙腈提取效果较好，再加以涡旋振荡后结合超声提高回收率。
2.1.2 固相萃取柱的选择
对于油脂类样品，采用固相萃取柱进行样品净化是必不可少的步骤。结合相应参考文献，本实验采用了硅胶、PSA、Florisil、Alumina等填料的固相萃取柱，结果表明对于植物油，硅胶柱相对于其他填料的固相萃取柱来说，2-DCB 和2-TCB回收率较高，添加回收率达到了80%-120%，满足分析检测的要求，且达到很好的净化效果。如图2所示

A：标准品；B：空白样品；C：添加标品的样品

图2  植物油空白样品及其添加样品的总离子流图

2.1.3 淋洗曲线的建立
固相萃取技术最重要的目的在于通过固相萃取柱将目标化合物与主要干扰物分开，从而实现净化的目的。在此过程中应非常注意选择合适的洗脱溶剂。样品处理过程是先用正己烷将其中的中性化合物除去，参照Horvarovich 等报道，用硅胶柱分离样品中的2-DCB和2-TCB，选用弱极性的甲基叔丁基醚（methyl-t-butyl ether，TBME）/正己烷（V/V）混合溶剂将稍强极性的2-DCB 和2-TCB洗脱下来。由于样品基质与文献不一样，淋洗液与洗脱液的选择也会不一样。因次需要考察正己烷以及其与甲基叔丁基醚不同比列的混合液作为洗脱液时2-DCB和2-TCB的回收率。选用5根ProElut Silica固相萃取柱，取0%、0.5%、1%、2%、5%不同浓度的甲基叔丁基醚：正己烷（V/V）作为洗脱液，所得回收率结果如图3所示。

图3  2-十二烷基环丁酮（2-DCB）和2-十四烷基环丁酮（2-TCB）在ProElut Silica上的淋洗曲线

由图3可知，当甲基叔丁基醚浓度低于1%（V/V）时，2-DCB和2-TCB没有被完全洗脱下来；而当甲基叔丁基醚浓度高于1%（V/V）时，虽然有回收率，但是悬蒸瓶中出现了油滴，且随浓度增加，出油的现象更加严重，从而会影响2-DCB和2-TCB的定量。因此本实验采用正己烷作为淋洗液，甲基叔丁基醚：正己烷(1：99 V:V)作为洗脱液。

2.2 定量分析2-DCB和2-TCB方法的评价
2.2.1 线性范围和定量限
用2-DCB和2-TCB标准中间液配制质量浓度系列为0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL的标准工作溶液，进样后以峰面积为纵坐标，以2-DCB和2-TCB的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算相关系数。方法在0.01～0.5μg/mL范围内方法线性良好，线性相关系数分别为0.99938和0.99977。将加标质量浓度逐级稀释添加于空白样品中，经过和样品相同前处理后上机测定，以10倍信噪比确定方法定量限为10μg/kg。
2.2.2 方法回收率和精密度
为了验证测定植物油中2-DCB和2-TCB含量的方法的准确性和可靠性，对所选择的测定方法进行加标回收率实验。分别测定了不同水平2-DCB和2-TCB加入量的加标回收率。具体实验结果见表1。

表1  2-十二烷基环丁酮（2-DCB）和2-十四烷基环丁酮（2-TCB）的加标回收率测定

Table1  Analyticalresults and recoveries of target analytes in samples by SPE-GC-MS

从表1可以看出，在不同添加水平下，回收率都在78%～91%之间，相对标准偏差小于6%。结果表明该方法回收率和精密度完全可以满足一般检测的要求。

3 结  论

      本实验建立了植物油中2-十二烷基环丁酮（2-DCB）和2-十四烷基环丁酮（2-TCB）的气相色谱-质谱联用的测定方法，前处理步骤较简单，可操作性强；相对于GB\T21926-2008《辐照含脂食品中2-十二烷基环丁酮测定气相色谱/质谱法》用弗罗里硅土作为吸附剂，采用ProElutSilica 固相萃取柱净化的方法, 大大缩短了分析时间, 节省了溶剂, 并具有较好的回收率和重复性, 同时扩大2-DCB和2-TCB的检测范围，有较高的实际应用价值。

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