主题：【分享】液相色谱常见问题及解答（整理版）

跟大家分享一下液相色谱常见问题及解答，已经整理好一部分，欢迎来补充。
1.流动相：流动相首选甲醇-水，其比例根据被测药物的极性而定，被测药物的极性小则70％甲醇先试，被测药物的极性大，则30％甲醇先试，被测药物的极性中等，则50％甲醇先试，当然还要根据药物结构的不同，选用一些添加剂和缓冲盐等。
色谱柱：柱子以ODS柱，即C18为通用。被测药物的极性小，可用C8或氰基柱等，被测药物的极性大，则可选用氨基柱或能用纯水洗的改性柱。
检测波长：如果所测药物不是在近UV区<215nm，波长只要能满足检测需要，应以靠长波方向及不是坡度太大之处为宜，这是药品分析与生物分析的不同之处。
匆此。
我再补充些:
流动相:还可通过调节缓冲液的PH来改善峰型,如酸性的药物可加入适当的酸如磷酸、乙酸等,碱性药物可加入适当的碱如三乙胺等
柱：同时还要考虑不同柱之间的差异，同样ODS或C8会有不同的适合范围，可看柱说明书。
波长：当然还要考虑杂质的吸收，测含量可照上。
由于在反相色谱中，极性大的先出峰，所以可减小有机相来增加RT
一、
问：我想请教安捷仑1100色谱仪B泵的泵头压力(PURGR压力)比A泵的高30BAR(使用用一溶剂情况下),咋回事?
答：你可以检查一下A、B各流路的管道、泵或者滤头等是否有堵塞的问题，也许是某个地方脏了。
二、
问：为什么进样器内的玻璃衬套会对色谱行为造成影响？
答：进样器内的玻璃衬套主要有下列作用：
1．提供一个温度均匀的汽化室，防止局部过热。
2．玻璃的惰性不不锈钢好，减少了在汽化期间样品分解的可能性。
3．易于拆换清洗，以保持清洁的汽化室表面，一些痕量非挥发性组分会逐渐积累残存于汽化室，高温下会慢慢分解，使基流增加，噪声增大，通过清洗玻璃衬套可以消除这种影响。
4．可根据需要选择管壁厚度及内径适宜的玻璃衬套，以改变汽化室的体积，而不用更换整个进样加热块。从以上几个方面可以知道玻璃衬套对色谱行为造成影响的原因。

三、
问：毛细管色谱分流进样时，非线性分流的主要原因是什么？
答:1．进样器温度太低，样品汽化不完全，发生分级分流。
2．进样器温度太高，某些组分可能发生热分解，也有的样品可能发生催化分解，或样品部分地被吸附在进样器内表面上。
3．在分流点以前样品没有混合均匀或混合不充分。
4．系统的进样垫、柱接头等地方漏气。

四、
问：HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法
答: 1．样品量不足，解决办法为增加样品量
2．样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3．样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器
4．检测器衰减太多。调整衰减即可。
5．检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数
6．检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。
7．检测池中有气泡。解决办法为排气。
8．记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。
9．流动相流量不合适。调整流速即可。
10．检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
五、
问：做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？
答：原因可能有：
1．泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；
2．比例阀失效，更换比例阀即可；
3．泵密封垫损坏，更换密封垫即可；
4．溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；
5．系统检漏，找出漏点，密封即可；
6．梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
六、
问：做PGS/MS分析时，如何防止焦油状污染物进入毛细柱？
答：聚合物，尤其是一些含氮，硫及卤素的高分子裂解时，常有焦油状物质产生。为防止这种焦油状物质进入毛细柱造成污染而使柱性能下降，可采用保护预柱，即在裂解器与毛细柱之间接一填充预柱，通过控制预柱温度而使焦油状物质滞留在预柱内，预柱可置于GC气化室内，这样既容易控制温度，又减少系统的死体积，当然，预柱填料需经常更换。
七、
问：我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么？
答：这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各
组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺（TEA），将会使硅醇基的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。
八、
问：我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？
答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
1．拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；
2．把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；
3．将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查.
4．更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
九、
问：高温毛细柱的使用寿命一般为多长？
答：毛细柱寿命锄决定于柱子本身的性能外，在很大程度上取决于使用情况，如使用温度、样品状态，进样量等，如果在其使用温度范围内，样品干净，色谱柱不被污染的情况下，柱子寿命一般在2-3年之间。
十、
问：如毛细管柱被污染，柱效和分辨率降低，有何方法使它恢复？是否可通过老化来解决？
答：根据柱污染程度可采取不同的方法来解决，如果污染不严重，污染物沸点不是太高，可通过老化来解决，但老化温度不可超过柱子的最高使用温度，且一般要较长时间（8-30）小时，如果污染较严重，或通过老化仍不能使柱性能恢复，那就必须采用溶剂清洗，通常是用5倍柱容积的溶剂（如正戊烷，二氯甲烷等）通过色谱柱。当然，清洗熔剂用的越多，对柱性能的损坏越大，清洗完后，在通载气老化一定时间，如果柱性能恢复，便可继续使用。必须指出：只有交联柱才能清洗，对于非交联柱，清洗柱子会彻底失效，因为固定液被洗掉了，至于清洗用熔剂的选择，可参考说明书。
十一、
问：BPX70毛细柱是否可用于GC/MS分析？
答：完全可以。BPX70为极性柱，使用温度范围宽（25-260C），程序升温可达290C，流失低，适合于分析脂肪酸甲酯的的各种位置和几何异构体，药物异构体，碳水化合物等。因BPX70为交联柱，故用于GC/MS很稳定，污染后可清洗再生。
十二、
问: 用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？
答:关于漂移问题：
1．温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定
2．流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等
3．柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡
关于快速变化问题
1．流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定
2．泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。
3．流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合
十三、
问: 色质联用中毛细柱的选择应注意什么问题？
答: 1．柱效要高
2．热稳定性好
3．化学惰性强
具体选择应注意
1．柱极性。根据分析样品选择不同极性的柱子进行分析
2．柱子内径。内径大小决定柱容量
3．液膜厚度。分析样品温度不一样，对膜厚有不同要求，温度高液膜要厚，温度低液膜要薄
4．柱长度。柱越长，柱效越高，分离效果越好，但也存在吸附问题，柱子过长，分析时间长，因此要根据样品考虑柱子长度.
5．外涂层（柱体）的选择。
6．另外还有仪器型号、分析对象等因素
十四、
问:液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？
答: 1．筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
2．存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子
十五、
问：从那些方面可以简单判别毛细管柱子的热稳定性好坏？
答： 1．分配容量（或容量因子）K，好的柱子在高温运行后，分配容量K不应有明显的下降，否则，说明柱子的热稳定性不好
2．理论塔板数n，热稳定性好的柱子经受高温后，理论塔板数应基本保持恒定
3．柱子的极性。热稳定性好的柱子，高温前后极性变化不大，具体表现为保留指数I值没有大的变化。
4．噪声。热稳定性好的柱子在高温下使用后，噪声不能增加。
5．柱子的去活层，毛细管柱子涂固定液前内部一般要用去活性试剂去活以增加惰性。质量好的毛细管柱子高温后，去活层不应该变化，表现在对强极性样品或酸碱性样品的吸附性不能增加。
如果没有堵塞的话，你可以把泵阀逆时针拧松，然后用溶剂以5ml\min冲5分钟然后再调回来试试
十六、
问：流动相的保存期限一般为多少？如果是甲醇：四氢呋喃：乙腈：水/30：10：30：30可以保存多少时间？如果含缓冲盐的可以保存多少天？保存期限与缓冲盐的浓度有关系吗？听别人说用缓冲盐只能用3天，是为了防止长菌还是析出盐呢？
答：流动相的保存期限要具体问题具体分析，如果是有机相（或者纯水）则可以保留4-5天，当然肯定是保留时间越短越好了，在做实验时可以估计一下大概需要多少，不要过滤过多的有机相或纯水。如果是甲醇：四氢呋喃：乙腈：水/30：10：30：30，因为水相还是占相当大的比例，通常不宜超过1-2天。如果含缓冲盐的则最好当天用完，不要留置过夜，用不完也要倒掉，这是为了保护好机子起见，保存期限与缓冲盐的浓度有关系，越浓越不宜保留，总之，我认为缓冲盐溶液都不宜保留超过24小时，HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。如果你的液相有在线Seal-wash功能，则能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。通常缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.
我认为一次性配制的缓冲盐不能用3天，无论是从为了防止长菌还是析出盐方面考虑。我觉得做液相也要事前作好各方面的计划，作到心中有数，这样即可以保护好机子设备，又能节省溶剂，不要为了图一时的方便而因小失大！
十七、
问：单纯的甲醇冲洗柱子的时候用了1周是否需要重新超声脱气？超声时间一般应为多少？我看过一个资料说需要30分钟，不应该吧？
答：单纯的甲醇冲洗柱子的时候用了1周有必要需要重新超声脱气（如果你的机子有在线脱气功能的话则不必重新脱气，现在出的大多数机子有这功能），超声时间一般为10-15MIN。
十八、
问：过滤流动相的时候，1张滤膜大概可以过滤多少毫升流动相，还是一直到过滤的特别慢了才弃用呢？是否过滤过含缓冲液的滤膜就不能再过滤不含缓冲液的流动相了？
虽然液相做了快2年了，但是这些细微问题始终没有得到真正的解决，恳请帮忙！
答：过滤流动相的时候，1张滤膜大概可以过滤多少毫升流动相并没有明确的规定，看情况而定，国外都是一次性的用，但在国内，由于国情的原因，大多数单位还是重复使用，我觉得只要自己认为脏了就可以换了，过滤过含缓冲液的滤膜就不宜再过滤不含缓冲液的流动相，当然如果经济不允许的话，就另当别论了。顺便给你点建小提示：
A：请严格执行溶剂过滤。

B：请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液

C：如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001---0.001M的叠氮化钠.

D：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。
十九、
问：我的柱压为什么一直很高？每天做完后我用于5%的甲醇0.2ml/min冲过夜，第二天用甲醇冲30min后再进行工作。
答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，我建议你可按下面步骤检查问题的起因。
1、拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；
2、把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。
3、将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，(此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动性)。这时，如果柱压仍不下降，再检查；
4、更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与柱子厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题。
我看到你用5%的甲醇0.2ml/min冲过夜，虽然流速很低，但你的水相占比例大，对柱子的寿命不好，不知道你的是长柱还是短柱，柱压有多高？请告知！
二十、
问：就是我们的液相泵，打开以后显示的压力不是0而是36psi，而且隔一段时间就要增长一些，我问别别人，他们说他们的机器也是这样，这是正常情况吗？是不是哪里堵了或者是泵头有问题，还是柱子用的时间长呢？
答：不知道你们用的是哪家的液相，我们使用的安捷伦1100，也出现类似情况，你试一试我们常用的方法看是否有效：
1. 使流动相处于purge 的状态，看压力是否降下来，如果是表明泵前的滤芯慢慢被堵塞了所以压力逐渐升高，不必担心，高到一定程度换滤芯就可以了；
2. 如果经常出现类似情况，一要确保流动相用前过滤，另外要检查液体中的小滤头是不是有漏的地方（过滤效果差了）；
3. 检查压力传感器是否正常，我们的一台液相就曾经因为压力传感器不正常工作而出现上述情况，更换了就好了。
4. 再有如果频繁出现压力持续升高，滤芯要很快就更换的话，请检查一下泵里边的密封圈是否有磨损，有时候会因为密封圈磨损掉屑而使滤芯堵塞，这时需要换新的密封圈（安捷伦的需要两个同时更换）；
5. 如果怀疑哪个地方堵了或者有问题，只要用分段排除法就能够一点点检查出来。

6.岛津泵不出液，一般情况下是单向阀的问题，光宁开泵抽气，效果一般不大，最好是把单向阀拆下来，用抽过的水超声，百试百中。我也遇到过这种情况，首先用针筒在单向阀出口给负压，进口处给予异丙醇，清洗单向阀。如果抽不出，可以用上面的方法判断，是哪个泵的哪个阀脏了（进or出），再将目标物放入装有异丙醇的烧杯超声。注意：1.超声频率不能太大 2.阀的放置方向
泮托拉唑分散片：Allitima C18 甲醇-0.05磷酸盐缓冲液(45:55)
血清中的泮托拉唑浓度：PlatinumC18，甲醇-0.02M醋酸盐缓冲液(40:60:5),内标：硝西泮 , 286mm
泮托拉唑手性拆分：chiral-AGP手性柱,流动相：乙腈-0.01M醋酸铵缓冲液(pH5.5)(8:92)，288nm，当pH>6.5时，保留时间明显增加，当pH>7时，出峰时间大于50分钟。当pH<4.5时，保留时间明显减小，分离度化学原理