主题：【新手求助】利用核磁共振研究蛋白质结构

NMR技术，特别是溶液NMR已广泛应用在蛋白质三维结构的测定上。用核磁共振方法可以解析的蛋白质的大小在过去几年中不断增长。2D NMR在蛋白质的应用是在80年代初由K. Wuthrich实验室与R. Ernst合作开创的，在此基础上Wuthrich提出了进行蛋白质NMR谱峰序列识别的方法，现在这一方法已成为所有蛋白质NMR谱峰序列识别的基础。用这种方法测定了一系列小蛋白的空间结构，除去特殊的例外，二维方法可测定结构的蛋白质大小的上限约100个残基。80年代末至90年代初，进一步发展了3D、4D NMR方法以及蛋白质同位素标记技术，A.Bax、M.Clore和A.Gronenborn的实验室在开发和应用3D、4D NMR方法于同位素富集的蛋白质方面起到了特殊的作用, 利用这些方法可以解析分子量15000-35000左右的蛋白质。
        尽管就储存在蛋白质数据库(PDB)的结构的数量而言，现在大约15-20%的新蛋白质的结构由核磁共振方法得到；而且PDB中的核磁结构有大约75%没有晶体结构，主要原因是这些蛋白质难以获得单晶；目前高精度核磁结构可相当于2.0-2.5 埃分辨率晶体结构。
        用核磁方法研究蛋白质结构的主要优点在于：蛋白质处于溶液状态；适合研究蛋白质-蛋白质，蛋白质-核酸，蛋白质-配基相互作用；可研究蛋白质分子内部运动；可研究膜蛋白。
        这里简要讨论确定蛋白质结构的方法，必须强调分子量并不是是否能成功地确定蛋白质结构的唯一判据。在进行结构确定之前，必须判断多肽或蛋白质是否聚集(通过考察NMR线宽的浓度依赖性或通过园二色性谱和超速离心分离研究)、蛋白质的折叠态是否对温度和pH稳定、内部的柔性(也由线宽反映)、化学位移的分散程度。如果谱线太宽，不能通过改变实验条件使其变窄，或化学位移的分散不足够大(往往发生于无结构的蛋白质或包含大量的简并残基的蛋白质)，于是一个分子量为5kDa的蛋白质也许比一个分子量为15kDa的蛋白质都要难于研究。也就是说，首先就得进行NMR结构研究的可行性论证，然后才开始结构研究。
    用核磁共振波谱测定蛋白质的溶液三维空间结构，一般按下述步骤进行：
    (1)选择最适的温度，pH值及溶剂条件，在D2O和H2O中进行一系列核磁实验；
    (2)进行谱峰证认，即确定不同核磁谱上的各个谱峰对应的蛋白质中原子；
    (3)获得一系列与空间结构相关的信息如NOE，J偶合常数等，用距离几何或分子动力学方法计算空间结构。
谱峰证认
        所谓谱峰证认就是将核磁谱上的共振峰同分子结构中的磁性原子一一对应起来，不仅要知道是哪种原子，还要确定是哪个原子，就蛋白质而言，就是要做到所谓的序列证认。
        对蛋白质的任何核磁共振研究，谱峰证认是必要的前提。当然，不同的研究的要求不同，有的只需要了解所用的共振峰的证认；有的则需要证认尽可能多的谱峰，结构计算就属于后者。因为结构计算需要尽可能多的1H-1H距离及其他二面角的信息。
        核磁共振谱得到的信息有三种可以用于谱峰证认：J偶合，提供原子间成键与否的信息，也可以说是分子结构的拓扑信息；NOE，提供原子间空间距离的信息；化学位移，不同的氨基酸残基中各类原子的化学位移往往有一定的分布范围。
        非标记蛋白质与标记蛋白质进行谱峰证认的策略不同。