主题：【第十届原创】3-氯-1,2-丙二醇的检测方法探讨

      3-氯-1,2-丙二醇是丙三醇上的一个羟基被氯原子取代后的化合物，是食品中的污染物，具有致癌性。目前酱油中3-氯-1,2-丙二醇主要来源于水解植物蛋白的副产物，其形成因素主要有蛋白原料的残留脂肪、高浓度的氯离子、大量过剩的酸、高回流温度以及较长的反应时间。2762中规定了酱油里3-氯-1,2-丙二醇的限量为0.4mg/kg。
      本次3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）的检测方法采用GB 5009.191-2016气相色谱-质谱-同位素内标法，样品中加入内标D₅-3-氯-1,2-丙二醇（D₅-3-MCPD），经硅藻土SPE柱净化，与标准系列溶液一起以七氟丁酰基咪唑衍生后（反应方程式如图1），增强其挥发性，再用气相色谱-质谱仪测定，内标法定量。试验过程中遇到一些问题，希望与大家分享交流。

图1 衍生反应方程式（上图为3-MCPD，下图为D₅-3-MCPD）

1、 色谱条件的确定
      由于刚接触气相色谱-质谱联用法，具体的操作流程还不太熟悉。刚开始未进行全扫描采集定性，直接采用SIM扫描，并且还设置了溶剂延迟，衍生后结果均未找到衍生峰。后期用衍生后标准溶液全扫描后发现衍生峰竟在溶剂延迟前出峰，根本就没有采集到。为避免此类事故的发生，由此制定了以下流程。
      本法采用HP-5 MS弱极性毛细管柱，采用梯度升温的方法，先对标准溶液的HFBI衍生物进行全扫描质谱采集，将得到的总离子流图（TIC图）提取色谱图，进行定性，找到目标物3-MCPD和内标D₅-3-MCPD衍生产物的峰位置。由此可设定溶剂延迟时间以保护灯丝寿命，目标物出峰后的程序升温过程即冲洗柱子将残留在柱子中杂质冲出，这段时间可不进入质谱，以减少对离子源的污染。
      然后采用选择离子扫描（SIM）采集，3-MCPD衍生物特征离子：m/z 253（定量离子）、m/z 275、289、291（定性离子）；D₅-3-MCPD衍生物特征离子：m/z 257（定量离子）、m/z 278、294、296（定性离子）。由得到的峰面积内标法定量，离子丰度比定性。
2、 衍生试剂及衍生条件的确定
      常用的衍生试剂有七氟丁酰基咪唑（HFBI）和七氟丁酸酐（HFBA），但HFBA产生的副产物七氟丁酸可能会降解氯丙醇衍生物，因此选择HFBA。
      前期试验中两次衍生的结果均未找到目标物的衍生峰，找了好久的原因，包括比对定量离子对和定性离子对、探究反应机理、排查标准物质、定容试剂以及衍生试剂，最终发现衍生试剂HFBI和HFBA混淆，误用了HFBA，导致未找到衍生物峰。本实验室两种衍生试剂都有，试验过程中因疏忽大意，将两者混淆，着实给我们一个教训，实验前一定做好准备工作；另外若发现试验出现问题，寻求原因时可从源头开始，从标准品和试剂着手排查原因。
3、 线性范围的选择
      在日常检验中，经常会有检出量特别大甚至超标的样品，很有可能超出了线性范围，这样标曲就没有意义了。遇到这种情况可有两种解决方案。一是将标曲线性范围扩大，多衍生几个标曲点，确保样品中被检测物含量在线性范围内；二是减小称样量，若称样量少不具有均一性和代表性的话，还可在检测过程中做稀释处理，使样品含量在线性范围内。
4、 硅藻土SPE柱
      硅藻土具有很好的吸水性，可降低3-氯-1,2-丙二醇在水相中的溶解度。我们选用成品硅藻土SPE柱（Agilent Chem Elut）与自制硅藻土柱（脱脂棉-硅藻土-无水硫酸钠）进行比对。发现回收率相差不太，均在95%~110%之间。从净化效果来看，差异也不大，从节约成本方面综合分析，还是选用自制硅藻土柱。
      选用正己烷作为淋洗溶剂，可去除一些脂溶性杂质。最后用乙酸乙酯作为洗脱液将3-氯-1,2-丙二醇全部洗脱。
5、 内标法数据分析
      将采集的数据定性后确定保留时间，设置内标化合物及其浓度，建立标准曲线的级别和浓度，内标法定量。
      在此过程中，若样品中目标物有共流出现象，定量离子有干扰，积分不准确的情况下，①可以重新优化前处理方法-SPE净化；②若其他特征离子没有干扰且灵敏度足够高的情况下，亦可将此离子作为定量离子，重新分析，离子丰度比需在规定范围内。
      通过这次试验，让我明白了每一个项目的方法开发、每一批样品的检测都应做好充分准备，包括标准溶液的配制和比对，所用试剂的种类、浓度和有效期，前处理步骤的先后顺序、时间长短以及关键点，检测器、色谱柱、流动相的选择，数据分析的全面性（保留时间、定性离子、定量离子、NIST库）；提前查阅文献和资料熟知试验过程及每个步骤的作用和原理，不得有半点马虎，否则做一些无用功，即浪费资源又浪费时间。希望通过这次3-氯-1,2-丙二醇检测中的亲身体会，与大家分享，也告诫一下自己，不断努力，不断提高自身的技术水平。