主题:【转帖】常用色谱和光谱分析方法和技术(续3)

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几种颇有应用潜力的光谱分析方法:
一、差示分光光度法(Difference Spectrophotometry):简称ΔA法。取两份相等的供试液,一份加酸,另一份加碱或缓冲液或其他能够发生某种化学反应的试剂,有时也可不加任何溶液,然后将两者分别稀释至同样浓度,一份置样品池中,另一份置参比池中,于适当波长处,测其吸收度的差值(ΔA值),在供试溶液的一定浓度范围内,ΔA值与浓度C之间呈线性关系。优点:在不同pH介质中,或经适当化学反应后,供试物发生了特征性的光谱变化,而赋形剂或其他共存物质不受pH条件或化学试剂的影响,未引起光谱变化,从而消除了它们的干扰。同时,参比池与样品池中含有相同浓度的供试物与干扰物,这就为吸收度的测量提供了一个近似理想的参比溶液。
    ΔA法主要有:
      1、利用最大吸收波长进行药物的测定:紫外光谱对pH十分敏感时,可测得ΔA(碱-酸)或ΔA(pH7-酸)。
      2、利用最大吸收与最小吸收之差(即振幅)进行药物测定:某些药物共存物在某pH范围内的光谱与pH无关(即吸收度不变)。而主药有最大和最小吸收,两者差值与主药浓度成正比。
      3、利用干扰杂质等吸收波长进行测定:于干扰物的等吸收波长处进行测量,如测得供试物的相应吸收度,即可消除共存物的干扰。
      4、利用最小吸收波长(lmin)处的增色效应进行测定:某些药物在碱性和酸性溶液中于处吸收重叠,但吸收值不同。但在碱性或酸性溶液中于lmax或lmin处可产生增色效应,利用此效应可测定药物浓度。
二、正交函数分光光度法(Orthogonal Function Spectrophotometry):在分光光度法中,任何一条吸收曲线,都可由一组正交多项式来描述它:
f=r0f0(l)+r1f1(l)+……+rkfk(l)
其中系数ri=Sfi(l)f(l)/si, 式中:si为归一化因数,fi(l)可从“正交多项式表”查得,f(l)为所选波长区间内等间隔的各点波长处的吸收度,N:为测式点数(须大于i+1)。N值越大,所得ri值越精确。
ri是吸收度A的函数,ri∝C,则ri=AjCA ,Aj是常数,类似于经典分光光度法中的比吸收系数,数值上等于光路长为1cm、CA=1%(w/v)时的ri,常写作:ri(1%,1cm),取样品与对照品在同样条件下测N点吸收度,计算ri,根据式:ri测=ri(1%,1cm)×CA可求得CA。
在两组分混合液测定时,ri混=riA(1%,1cm)×CA+riB(1%,1cm)×CB,可适当选择其中的ri和波长区间,就可使riB×CB小到可以忽略不计,从而可以如同测定单一组分一样,由混合物的ri和对照品的ri(1%,1cm),求出混合物中组分A的含量;反之,同理也可测定组分B的含量。

三、近红外光谱分析法(Near intra-red spectrum,NIR):波长范围800~2500nm(12500~4000cm-1),优点:1、没有中红外光谱(Mid intra-red spectrum,MIR,4000~400cm-1)吸收带显示出的边缘干扰(fringe interference),故在一较大的吸收动态范围内这些吸收带强度与被测物浓度之间有线性关系;2、和MIR不同,水分吸收不会覆盖C-H、N-H和O-H的吸收带,因此,NIRS(NIR Spectroscopy)可用于水溶液样品、含水固体和泥浆状样品的分析;3、样品可不经溶剂稀释、制备溴化钾片等处理而可直接测定,免除样品制备时可能带入的误差,因而其定量效果优于GC、HPLC和FTIR等法。
药典中原料药多用MIR作指纹分析,或以标准图谱核对,或与参比标准对照,所得光谱质量多取决于样品制备的准确性和重现性,而且操作繁琐、影响因素很多。NIRS法则方便得多,仅需将样品装入样品池内而不必作预处理。一般,液体样品可直接装入光路长1~30mm的石英池中。固体样品可直接放入具有石英窗的反射样品杯中;盖上弹簧压缩盖即可。在1分钟内即可完成装样;取出样品、清洗杯子的时间也不需1分钟。通常将样品杯置入NIR光谱仪内,每秒进行5次扫描;一般扫描50次求得平均值制得最后的光谱,继之将光谱数据进行加工以作数据的定量或定性的解释。通常一次NIR分析仅需2~3分钟。
(一)用于鉴别:目前常用的是借助于计算机辅助的光谱匹配法(Spectral matching),就是将供试药物的光谱和存贮于机内的参比光谱进行对比并计算出“匹配系数(Match index,M.I.)”。若M.I.越接近1.000,则这两个光谱越是匹配;而当M.I.接近于0.000时,则为极不匹配。有时会出现负值。

式(1)中,X和Y是二个光谱的矢量表示(Vectorial representation); 式(2)中Xi是光谱A在波长i处的振幅(吸收度);Yi是光谱B在波长i处的振幅(吸收度)。矢量X和Y是由光谱A和B的N个波长处所得吸收度读数总和而得到(在某波长范围内每隔Mnm测一次吸收度,故有N个波长点)。在N维空间中这二个矢量具有不同的大小和方向。这二个矢量间可形成一个夹角(q),夹角的cosq即可确定M.I.。若q=0°,则cosq=1.000;若q为90°,则cosq=0.000,二矢量正交,完全不重叠。若q大于90°,则cosq为负值,这种情况有时会出现。
(二)用于纯度检查:较纯的样品的M.I.等于或接近于1,而纯度稍差的样品的M.I.距1尚有一定的差距。
(三)用于含量测定:NIR漫反射(NIR diffuse reflectance)吸收度(-lgR;R代表漫反射)与样品中待测组分浓度之间存在着一定的内在关系,样品i中某一组分的浓度yi可用这个样品在m个不同波长处的吸收度Xik(k=1、2、…、m)的线性组合来表示:
式中,F0为与仪器有关的校正常数;Fk(包括F1、F2、…、Fm)为在波长1、2、…、m处待测组分或基质的校正系数;数值为正时表示这一波长为组分的特征波长;为负时表示系基质的干扰波长,应将此值扣除。上式也可改写成具体公式:
组分%=F0+F1log(1/Rl1)+F2log(1/Rl2)+…+Fmlog(1/Rlm)
式中的校正常数(F0)和校正系数(Fk)通常是选用n个浓度已知的样品作为校正集(Calibration set),分别测得校正集样品在m个不同波长处的吸收度,再用多元线性回归(Multiple Linear Regression,MLR)或偏最小二乘(Partial Least Square,PLS)算法,借助于电子计算机进行数据处理以求出校正常数和系数,同时选择出校准的最佳波长,并获得各相应组分的校准公式,之后用于实际样品的测定,即得。校准公式一旦建立,实际测定时方法简易、快速、精确。
四、核磁共振光谱定量分析法(NMR):(一)特点:1、对于确定的核(质子),其信号强度与产生该信号的核(质子)的数目成正比,而与核的化学性质无关。2、利用内标法或相对比较法,分析混合物中某一化合物时可无需该化合物的纯品作对照。3、信号峰的宽度很窄,远小于各信号之间的化学位移的差值,因而混合物中不同组分的信号之间很少发生明显的重叠。4、方法简易快速、专属性高,可选择性地测定复方药物或药物制剂中的组分乃至药物的立体异构体;一般无需分离,且不破坏被测样品。
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(二)定量分析方法:NMR图谱中,可获得化学位移、偶合常数、共振峰面积或峰高。化学位移和偶合常数是结构测定的重要参数;而共振峰面积或峰高是定量分析的依据。共振峰面积或峰高直接与被测组分的含量成正比。定量分析时,一般只对该化合物中某一指定基团上质子引起的峰面积或峰高与参比标准中某一指定基团上质子引起的峰面积进行比较,即可求出其绝对含量。当分析混合物时,也可采用其各个组分的各自指定基团上质子产生的吸收峰强度进行相对比较,然后求得相对含量。因此,在测量峰面积或峰高以前,必须了解化合物的各组成基团上质子所产生共振峰的相应位置,也就是它们的化学位移值(d值),并选择一个合适的峰作为分析测量峰。常用的NMR定量分析方法有:
1、内标法(绝对测量法):在样品溶液中,直接加入一定量内标物质后,进行NMR光谱测定。将样品指定基团上的质子引起的共振峰(即吸收峰)面积与由内标物质指定基团上的质子引起的共振峰面积进行比较,当样品与内标均经精密称重时,则样品的绝对重量(Wu)可由下式求得:Wu/Ws=Au·EWu/ As·EWs —— Wu=Ws·Au·EWu/ As·EWs 式中:Au为样品测得和峰面积(不少于5次测定的平均值);As为内标物测得的峰面积(不少于5次测定的平均值);EWu为样品在该化学位移处的质子当量;EWs为内标在该化学位移处的质子当量。若样品重为W,则百分含量=Wu/W ×100%
对内标物要求:(1)最好能产生单一的共振峰,在扫描的磁场区域中,参比共振峰与样品峰的位置至少有30Hz的间隔;(2)应溶于分析溶剂中;(3)应有尽可能小的质子当量(EWs);(4)不应与样品中任何组分相互作用。常用的内标物有:苯或苯甲酸苄酯(在5.3ppm处,由C6H5COOCH2-C6H5中的-CH2所致),适用于非芳香化合物;马来酸,适用于非链烯型化合物。
2、相对测量法:当不能获得样品的纯品或合适的内标时,可用相对测量法进行分析。操作方法与内标法相同。计算相对含量是以样品指定基团上一个质子引起的吸收峰面积(A1/n1)和杂质指定基团上一个质子引起的吸收峰面积(A2/n2)进行比较,然后按下式计算样品与该杂质的相对百分含量:
样品的相对百分含量={(A1/n1/[(A1/n1)+(A2/n2)]}×100%
式中,n1和n2是指定基团的质子数。本法适用于含有一、二种杂质的样品的分析。
3、外标法:欲测样品中某一组分的含量,可采用该组分的标准品做成一系列不同浓度的标准液,使样品液浓度在其范围内,然后进行NMR测定,由所得图谱中某一指定基团上质子引起的峰面积对浓度作图,即得标准品的校正曲线。在平行条件下,测定样品溶液组分指定基团上质子的峰面积,即可由校正曲线求得样品的浓度。
4、峰高或峰位测量法:结构相似的混合物样品(如互为异构体),由于其NMR峰分离效果不好,用峰面积定量法不能精确测定,误差较大,此时可考虑采用峰高测量法或峰位测量法。(1)峰高测量法:是基于峰高与样品中有关核的浓度成正比,各组分之间的峰高比只取决于样品的百分组成,而与样品的多少和仪器的性能无关。测定某一对异构体时,先用异构体I和II的纯品配成溶液,再用质子快速交换简化光谱。由简化的NMR光谱可知两异构体的吸收峰互不干扰;可测出各自峰高。两者摩尔数MI+MII=1,若两者的峰高为HI和HII,则:HI=MI×CI=(1-MII)CI ;HII=MII×CII ;两式中,CI和CII是异构体I和II的峰高系数,为已知,HI和HII可测得。据此可求得MI和MII。 (2)峰位测量法:当样品中两种组分之间具有可进行质子快速交换的基团时,经质子快速交换后,原来两种组分基团的信号合并,在NMR光谱上得到单一信号,此峰的化学位移与两组分的摩尔分数有线性关系,因此,测出混合物的化学位移,可直接求出二组分的混合比例。如有机胺及其盐的N-CHa上的质子可以进行质子快速交换,可用NMR法定量测定有机胺酸性水溶液的氯仿提取液中游离胺及其盐的比例。混合物中N-CHa的化学位移(dm)可按下式计算:dm=db+(da-db)Xa 式中db和da为纯的游离胺及其盐的化学位移,Xa为盐的摩尔分数。以dm对Xa或Xb(游离胺的摩尔分数)作图,应呈直线关系。因此可先用纯品配成已知组成比例的混合物,测得其dm并作出校正曲线后,再测得未知混合物的dm,即可由校正曲线求得Xa或Xb。
五、质谱及其联用技术:(一)质谱(MS)法常用的离子化方式:基本原理是将供试物分子经一定离子化方式,如电子轰击或其它离子化方式,一般是把分子中的电子打掉一个成为M+,继之裂解成一系列碎片离子,再通过磁场使不同质荷比(m/z)的正离子分离并记录其相对强度,绘出MS图。即可进行元素分析、分子量测定、分子式确定和分子结构的解析和推断等等。
1、电子轰击离子化(Electron Impact Ionization,IC):是最常用的一种,特点是可使分子引起相当大的碎裂,所得分子离子峰往往并不很强甚至不能识别。分子较大碎裂对供试药物的鉴定和结构解析是十分有利的;但对混合组分的分析和药物纯度检查是不利的。
2、化学离子化(Chemical Ionization,CI):是极为有用的一种,由于其谱形简单,能提供较强的准分子离子峰[Quasi-molecular,(M±H)+离子]和很少的碎片峰,因之,用于混合组分的分析和纯度检查是十分有利的。
3、场致离子化(Field Ionization,FI):非常适用于易变分子的离子化,如碳水化合物、氨基酸、多肽、抗生素和苯丙胺类药物均宜采用;此法也能产生较强的分子离子峰和准分子离子峰。
4、场解吸离子化(Field Desorption Ionization,FD):扩大了MS的使用范围,此法可用于极性大、难气化以及对热不稳定的化合物,因而在生物活性组分、药物及其代谢产物或分解产物的研究分析工作中是一种非常重要而且十分有效的分析工具。
5、负离子化学离子化(Negative Ion CI,NICI):灵敏度较高,可以提高到fg(10-15)水平,只要供试药物本身或通过衍生化后具有高电子亲合能力者,就可选用此法,而且可给出特征的负离子峰。
6、快原子轰击(Fast Atomic Bombardment,FA:是将样品溶解于低挥发性的液体基质中,用高速的中性粒子,如氩、氙等原子来轰击而解吸,因之称为快原子轰击离子化。特点:可直接进行分析,毋需做成衍生物;可适用于较大分子的MS分析,而EI、CI、FI、FD等方法只能用于中、小分子有机化合物的测定。如将FABMS与HPLC联用将成为适应力更强的分析手段之一。
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7、激光解吸(Laser Desorption Inoization,LD):是新近发展起来的一种有效离子化技术,能量高、指向性强,因此具有其它能源难以达到的离子化成效,可获得很强的准分子离子峰。
在MS分析中,究竟选用哪一种离子化方式,主要取决于供试物的稳定性和挥发度。
(二)MS与分离步骤的联用:MS已具有较高的鉴识和解析有机化合物的能力;但是如将其与某些适当的分离步骤联用,则会更有效地解决分析鉴定的难题。主要联用方式有:
1、薄层色谱-质谱联用(TLC-MS):是一种最简单的联用技术,目前多以“脱机”(off-line)形式进行,即将TLC分离出来的组分洗脱或连同少量吸附剂一并直接向MS仪中进样。此法可用于混合药物的组分鉴定、纯度检查和药物稳定性试验以及其分解产物的鉴定。检测水平一般低于mg级。常采用TLC/EI-MS方式进行。
2、气相色谱-质谱联用(GC-MS):是当前最为活跃的联用技术,其检测限可达10-9~10-12g水平。目前多用高分辨气相色谱-质谱(HRGC-MS)联用;其质量分析器部分,除了通常的磁铁式单聚焦质谱仪外,还有双聚焦质谱仪。也有采用四极质谱仪的,而且可进行快速记录,受到广泛重视。一般,供试物经GC分离为单一组分,按其不同保留时间,与载气同时流出色谱柱,再经接口(Interface),进入MS仪,然后可通过EI或其它方法产生一定的MS图谱,由计算机自动检索核对,即可迅速鉴识样品。通常在规定条件下所得的MS碎片图及其相应的强度,犹如人的指纹图一样,易于辨识,方法专属、灵敏,一般可检知1mg/1g的样品,甚至检知水平更微。常用方法有:(1)总离子流色谱法(Total Ionization Chromatography,TIC):是利用MS仪来记录色谱流出物的总离子流;这时,MS仪仅作为GC的检测器。因此,总离子流色谱图一般是与GC色谱图一致的。
(2)反复扫描法(Repetitive Scanning Method,RSM):在整个色谱分离过程中,MS仪可按一定间隔时间进行反复扫描,如每2~3秒扫描一次。在复杂的混合组分分析中,可得许多MS图谱,继之,用数据处理系统进行自动测量、记录和运算,最后根据GC图谱上的相应点,制得标准MS谱图。
(3)质量色谱法(Mass chromatography):将上述反复扫描所得并已储存在计算机中的MS图中重新画出一个或若干个碎片的洗脱过程图,因而也称之为重建离子流图(Reconstructed Ion Current Profile)。根据特征峰下的面积即可进行定量测定。优点是:即使分谱过程中分离很差或有峰重叠时,也能对测定物作出鉴定,并可于mg~pg范围内进行定量。
(4)质量碎片图谱法(Mass Fragmentography):也称多离子检测(Multiple Ion Detection,MID)或选择性离子监测Selected Ion Monitoring,SIM)。此法也是GC-MS测定中最重要的方法之一。系用保留时间为横坐标,记录一个或若干个特征离子碎片的强度所构成的质量碎片图谱,也就是进行选择性离子记录。此法可提高检测灵敏度2~3个数量级,达到pg水平。通过同时记录多个碎片及其相应的离子强度比,则可大大提高测定的专一性。测定时选用的信号离子碎片应具有特征性并尽可能有强的高峰。作成适当的衍生物往往会有利于碎片信号峰的产生。当采用四级质谱作为分析器时,由于它能进行快速的电场改变,因而可在谱的全程中任意选择几个碎片质量作成质量碎片图谱;而磁铁质谱仪仅能在峰的两侧的20%左右的质谱范围内选择其它信号峰。通过测量质量碎片图下的面积,即可进行定量分析。若以供试物的稳定同位素标记物作为内标,可用于人体上直接进行研究和测定,是十分理想的定量方法。此法大多已计算机化,整个过程十分快速而方便。
3、液相色谱-质谱联用(LC-MS):主要是HPLC-MS联用,由于接口技术的突破,HPLC-MS联用进入实用阶段。由于普通HPLC的洗脱速度约为1ml/min,这些流动相液体挥发成气体,将产生150~1200ml/min的气流。而正常真空状态的质谱仪仅能承受20ml/min的气体进入,若直接相连,质谱仪的真空系统会立即失效而无法工作。另外,HPLC常用于挥发性差、热不稳定化合物的分析,而经典MS离子化方法是将样品在真空条件下加热挥发成气体后进行离子化,两者联用时有可能发生样品热分解。CI、FAD等的使用,使发生热分解的问题得到解决。剩下的问题是找到理想的LC-MS接口,要求其应具有下列特征:(1)对HPLC系统应无任何特殊要求,并能保证其效率;(2)接口的死体积和时间常数要小;(3)采用EI或CI等离子化方法时,样品不分解;(4)采用接口后的LC-MS的稳定性和灵敏度应能与GC-MS相媲美;(5)价格应较合理。但目前尚无一种能完全满足上述要求。常用的LC-MS接口有:传送带接口(Moving Belt Interface,M、直接液体进样 (Direct Liquid Introduction,DLI)、热喷射接口(Thermospray,TSP)、电喷射接口(Electrospray,ESP)、单分散气雾形成接口(Monodisperse Aerosol Generation Interface,MAGIC)等。
4、串联质谱(Tandem Mass Spectrometry,TMS):即MS-MS。将第一台MS作为分离器,第二台作为分析仪器来对混合组分直接进行分析。此法具有三种扫描方式。第一种是子扫描(Daughter scan),代表混合物中某一特定组分的离子,由MS1产生,输入MS2的反应区,即可得到一幅代表最初选定的特定离子的谱图,即MS-MS子谱。此方式广泛用于鉴定特定化合物,这种离子谱是由初始离子产生的,因而也就是它相应中性碎片的指纹谱。第二种是母扫描,MS1扫描时,MS2保持恒定,得到可产生某一碎片离子的所有反应离子的谱图,即母谱。第三种是中性丢失扫描,两个质谱仪同时扫描,可给出原始混合物中所有通过丢失一个特定的中性碎片的离子的分子量。这种中性碎片常常是某种官能团的特征。和单级MS相比,此法能明显改善信号的信噪比,对测试样品的需要量也可大大减少。因之,此法特别适用于复杂混合物中痕量组分的鉴识。
(三)MS在药物分析中的应用:由于需样量少、检测限低。已广泛用于多个学科领域,尤其是药学学科。
1、用于药品的鉴定:依据是分子离子峰与其它特征峰以及它们之间的强度比。具有完全相同质谱的药物是十分罕见的,药物分子中的杂原子可产生一些适于鉴定的特征峰。
2、用于药品的纯度检查:若杂质分子量比药物分子量大,则很容量识别;若小,则只有当药物分子产生较少碎片,以及杂质的分子峰处于谱图的空位时才能检出。此外,杂质和药品间的挥发度比也是一个影响因素。若两者具有相同挥发度时,只有当杂质存在足够大的数量时才能被检出。
3、用于药品的定量分析:常以待测组分的特征峰峰强或面积对浓度作图,得出计算曲线,借以进行MS定量分析。为减少不同操作间的误差,往往需加入内标,以内标物对测定物信号的强度比和浓度作出计算曲线。
4、用于药物分解产物或代谢产物的研究:MS及其联用技术也可用于药物在温度、光线和机体代谢等因素的作用下所产生的分解物或代谢物的结构研究和量的变化。
5、用于混合药品或复杂组分的分析:这是最能展示MS及其联用技术才能的方面。既可借助于由混合组分的各自特征信号所组成的混合物MS图谱,也可与适当的分离手段联用后逐一鉴定之。



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