主题:【第十二届原创】趣谈凝胶渗透色谱GPC/SEC – 检测篇II之光散射

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  • 凝胶初辟本相对,打破传统需散射


终于写到了光散射部分,辉博士还是很兴奋的,毕竟搞了这些年色谱和光散射,很多陈谷子烂芝麻的往事和经验。静态光散射原理的发展快有一个世纪了吧,这项技术和GPC开始联用可以追溯到上个世纪八十年代,那是很多种新技术百花齐放、争相斗艳的年代。当然百花齐放不意味着每一朵花都能盛开到最后。国外很多公司设计出基于静态光散射和色谱连用技术的设备,有基于多角度外推的技术MALS(multi angle light scattering),也有基于小角度直接检测的技术LALS (low angle light scattering)。后来,呵呵,后来故事太多了,有些公司被收购,有些公司消失了,还有一些公司成长成为业内的翘楚!
博士对于开发这些技术的先驱们一直充满了崇敬之情,因为如果不是当年他们面对困难所付出的勇气和努力,对了还有智慧(智慧最重要,呵呵),就没有今天我们坐在这里侃侃而谈。
前面谈到单RI检测器通过校正只能得到相对分子量信息,对于想要了解高分子真实性能的科研工作者,这是远远不够的。在线光静态散射技术,不需要通过标准样品进行色谱柱校正,可以直接检测绝对分子量的结果,而高分子的绝对分子量直接决定了高分子的物理性能。在这一部分,我们聊聊在线光散射技术的原理和其功能。
在线静态光散射检测器通常和RI检测器在GPC中连用,某些行业中,如蛋白质检测,光散射则和紫外检测器连用也经常用到。
静态光散射原理

当一束光撞击到大分子或者颗粒的时候,一部分光会被吸收,并被重新向各个方向发射出去。当一个光子撞击到大分子的时候,光子的部分能量会引发大分子内部的偶极震荡。这部分能量随后以光的形式,向各个方向被重新发射出去。我们每天都可以见到这种现象,例如白云,日落,或者灰尘经过一束阳光或者投影。光散射方面的定律可以帮助我们测量很多和大分子相关的物理量。
瑞利理论描述了散射光强度与大分子的尺寸和分子量的关系,定义了发生散射的大分子和颗粒对散射光的强度的影响

其中C为样品的浓度,θ为测量的角度(散射角),Rθ 为θ角方向的瑞利散射比(散射光与入射光的强度比),Mw 为重均分子量,A2 为第二维里系数,K和Pθ的定义式为

其中λ0 为真空中激光的波长,NA 为阿伏加德罗常数,n0 为溶剂的折光指数,dn/dc为样品在溶剂中的折光指数随浓度增量

其中Rg 为大分子的旋转均方半径。
瑞利散射方程阐述了一定的角度下散射光强度与几个因素有关,其中包扩分子量和分子尺寸,请注意是两个未知数哦。同时也可以发现,较大的分子量和分子尺寸会产生更强的散射光。散射光强的增加与分子量的增加成线性关系,但是不与分子尺寸成线性关系。


散射光的角度依赖性

当分子具有较大的尺寸的时候,散射光的强度会随着散射角度的不同发生变化,这就是角度依赖性。
瑞利散射方程中,Pθ是高分子的形状因子,是未知项,不同的光散射技术对它的处理也不相同。我们再次看看Pθ的定义:

其中n0为溶剂的示差折光指数,Rg为大分子的旋转均方半径,λ0为激光在真空中的波长,θ为散射角。
从定义式中可知,1/Pθ受很多参数的影响,既包扩样品也包括实验条件,如溶剂的示差折光指数(n0),激光在真空中的波长(λ0)散射角(θ)和大分子的旋转均方半径(Rg)。
这意味着对于大分子,散射光的强度与测试角度相关,这就是角度依赖性。产生角度依赖性的原因,是当分子的尺寸增加后,散射光的光子彼此之间会发生干涉等相互作用,如下图

  • 各向同性的散射体的尺寸相对于激光的波长来说较小,各向散射光均匀分布。各向异性散射体的尺寸相对于入射激光的波长明显较大,各个方向的散射光强度不等。

  • 当大分子的尺寸相对于激光的波长来说较小的时候,如上,散射的形式表现为单点散射,这时各个方向的散射光的强度相同,这样的大分子被称为各向同性散射体。


当大分子的尺寸相对于激光的波长来说明显变大的时候,分子的尺寸和结构开始变得重要。来自激光的光子会在大分子中的不同部位发生散射。这种情况与大分子的Rg有关。这些发生散射的光子彼此之间相互作用,导致测量的光强受观测位置影响。这样的大分子被称为各向异性散射体。在各向异性散射中,所有的相互作用都是造成衰减的,因此散射光的强度相比于各向同性的散射是降低的。如果我们用这个散射强度去计算分子量,我们就会得到偏低的结果。
那么怎么办呢?瑞利散射方程告诉我们如果可以在0度角测量散射光强度,那么sin2(θ/2)就等于0,1/Pθ的值就是1。不过由于0度存在强度很高的入射激光,所以我们很难分辨出单独的0度角高分子散射光的强度。由于不能够直接在0度角测量,我们需要一种替代的手段。于是就出现了市场上的两种技术,即多角光散射MALS和小角光散射LALS。万变不离其宗,他们的目的都是为了检测0度角附近的散射光强,从而得到准确的大分子的分子量的信息,只不过,MALS利用的是外推的方式,LALS直接在0度角附近检测而免除了外推的过程。
总结:
  • Rg小于12nm(~入射激光波长1/40)的分子,散射光表现为各向同性,几乎不表现出角度依赖性,那么这时候任何角度检测的结果都是正确的,不需要多角MALS也不需要小角LALS,实际上一个单90度角得到的结果是非常好的

  • Rg大于12nm(~入射激光波长1/40)的分子,散射光表现出各向异性,散射光的强度与散射角有关,需要0度角的散射光强来准确计算分子量,此时需要多角MALS或者小角LALS技术



旋转均方半径Rg的计算


Guinier图表示KC/Rθ对应sin2(θ/2)的函数关系。其截距为1/Mw,起始部分的斜率与Rg有关



  • Rg可以从角度依赖性曲线(Guinier 图)中起始部分的斜率中计算

  • 必须要足够显著的角度依赖性来计算曲线的斜率


曲线起始部分的斜率可以表示为

Rg可以从这个公式中得到,然而,对于较小的大分子,曲线的斜率可能非常小,甚至淹没在噪音当中。只有当大分子的尺寸相对入射光波长非常显著的时候,曲线的斜率才会被精确的计算,从而获得可信的Rg。入射波长为633nm激光可以计算的Rg的下限约为12nm左右。但是,绝对的下限可能高于或低于12nm,这与样品,溶剂和测试条件都有关系。很多MALS仪器制造商提出的Rg下限为10nm(甚至更低),这通常是对于标准样品或者具有较高dn/dc或者浓度的样品的理想情况。实际使用的过程中,很多样品无法达到这样的下限。另外极端条件如样品的dn/dc很低或者不在理想条件下,其Rg的下限都会远高于12nm的理论值。

GPC/SEC与静态光散射连用


GPC/SEC可以使我们轻松的将光散射数据和浓度检测器提供的数据联系起来进行计算。最常用的浓度检测器是示差折光检测器RI或者紫外检测器UV。
现在常用的静态光散射仪器有2种,分别RALS与LALS联用,和多角光散射MALS。

光散射检测器1 - RALS/LALS直角和小角联用光散射检测器

RALS与LALS具有一定的互补性的。RALS灵敏度高,适合测量散射光各向同性的样品,LALS适用于测量散射光各向异性的样品,可以提供非常准确的结果。如下图,RALS/LALS联用检测器将两种检测器整合在一个流通池当中。在Zimm图上,RALS主要测试分子尺寸小于临界半径12nm的各向同性散射体,LALS则精确测试分子尺寸大于临界半径12nm的各向异性散射体。软件会自动根据检测器的信号在RALS与LALS之间进行切换。对于各向异性散射体,两个检测器计算的分子量的比值可以用于估计Pθ,这样再对分子结构进行假设(无规线团或刚性球),就可以估计分子的Rg了。

左图,RALS/LALS联用检测器结构与流通池流路。激光从流通池末端进入,检测器布置在90度和小角度方向。右图,使用RALS/LALS联用时,对应的Zimm图为两个点,其中RALS为各向同性散射体提供高灵敏度的检测,LALS为各向异性散射体提供高精确度的检测
RALS/LALS联用的特点:
  • 对于分子体积不大的大分子,RALS可以提供最高的灵敏度
  • 对于分子体积较大的大分子,LALS可以提供最好的准确性
  • 可以比较两个角度的散射光强度
  • 对两个角度的数据进行分析,可以计算Zimm曲线的斜率,进而计算Rg,当然这个Rg的准确程度比MALS得到的Rg要差一些,毕竟只有两个点的外推
  • RALS/LALS联用检测器具有很小的流通池,这其实是相对MALS检测池的优势之一,毕竟检测池小了,扩散效应会降低很多



光散射检测器2 - 多角光散射MALS
如名称所示,MALS检测器在多个角度检测散射光的强度,如下图。将这些角度的数据点添加在Zimm图中,通过最合理的拟合曲线外推至0度角,就可以计算分子量。曲线起始部分的斜率可以精确的计算分子尺寸Rg。

左图:MALS检测器结构与流通池流路。激光从流通池末端进入,检测器布置在多个角度方向上 。右图:使用MALS时,可以得到一条完整的拟合曲线 ,这条曲线外推至0度可以计算大分子的分子量,曲线起始部分的斜率可以计算Rg



多角光散射的外推模型
小分子

  小分子线团、蛋白质、单克隆抗体等样品为均匀散射,不需要外推。

大分子

  外推模型包括:
  • Zimm外推,Kc/Rθ对于    sin2(θ/2)外推拟合,适用于适用于适中分子大小 Rg ~ 20-50 nm的分子线团
  • Deby外推,Rθ/Kc 对于    sin2(θ/2)外推拟合,在一个比较宽的Rg范围内使用,是一种广谱的拟合模型,其适合范围比Zimm模型更加宽泛
  • Berry外推,(Kc/Rθ0.5对于 sin2(θ/2)外推拟合,适用于比较大的分子 Rg > 50 nm



左图:为小分子量聚合物的Zimm曲线,散射光为均匀散射,没有角度依赖性
右图:为高分子量聚合物的Zimm曲线,散射光为非均匀散射,具有角度依赖性,需要外推得到0度角的散射光

 
    其中在拟合过程中,用户可以适当删除一些与拟合曲线偏差较大的光散射数据点,以及使用1-5阶指数拟合方式(线形好尽可能用低阶指数),以达到更好的拟合效果。
MALS特点:
  • 由于可以获得多个角度的散射光强度,使用者可以通个比较相邻的角度的数据更好的确定结果的准确性
  • MALS可以测量各种大分子的分子量,因为计算过程已经将角度依赖性考虑在其中了
  • 通过多个角度的数据,可以精确的计算Rg
  • 根据Zimm曲线的形状,MALS可以洞察散射光的角度依赖性的情况
  • 需要选择合适的模型,这点非常重要,毕竟Zimm,Debby,Berry的最适合的范围不同
  • 如果某个角度的数据不合理或者噪音太高,计算过程中可以将其去掉,这样做不会对结果造成太大的影响
  • 光学元件的设计导致散射池体积较大,这会造成比较大的扩散效应


当使用MALS时候,最为关键的一点是能不能确定拟合曲线的类型,而精确的拟合曲线主要是由精确的低角度的数据的数量决定的。因此一台MALS应该配置尽可能多的低角度接收器,这有助于提高外推至0度角的准确性。总体上对于不同类型的MALS而言,角度越多,外推过程的准确性就越好。
趣谈1 光散射检测器角度越多分子量检测越准?
这真的是一个需要很多前提条件的论断。
首先,12nm以下的小分子散射是均匀的,任何一个信噪比良好的角度得到的散射光强计算分子量都可以得到准确的结果,不必需要0度角的信号意味着既不需要多角度MALS的外推也不必需小角度LALS的信号。这在众多通过90度角单角度检测蛋白(如人学白蛋白HA,单克隆抗体)的用户实际检测中得到了验证。不但单抗单体150KDa检测极为精确,而且其他的寡聚体峰,如二聚体300KDa,三聚体450KDa都没有任何问题。
而在检测大分子的过程中,小角光散射LALS的准确度并不比多角差。实际上,因为不需要像MALS一样选择模型进行外推(外推过程中的选点,选模型,选择拟合阶次都是具有一定主观性的),在检测分子量的角度,小角度的准确性甚至更高。很多GPC的专业书籍都对此有所描述:

所以,我的观点是只有当您:1选择了多角光散射MALS作为检测器,2检测大分子的时候,角度越多分子量越准。毕竟角度越多越有利于外推的准确性。但是话说回来,如果您特别在意Rg的检测的话,那么多角度还有有其优势的。

趣谈2光散射检测器不需要校正
    很多厂商都是这么说的,但是,实际上完整的表述是,光散射检测器不需要做传统校正曲线!在不同的流动相下,其光散射检测器的光学常数不同,这个光学常数以及检测器之间的保留体积需要通过一个窄分布的标准样品校正出来,而一旦校正出来常数,做任何样品都是一样的。据博士所知,所有厂商都是如此!!!

趣谈3装了光散射检测器的GPC是不是所有样品都可以检测?


光散射检测器不是万能的,也有其限制。
限制1. 分子量或者dn/dc极低的样品。这时候散射光强会很弱,有可能散射信号的信噪比很差,此时光散射结果会有较大偏差
限制2. 多组分混合物,这里指的是不同化学结构单元的混合物,如聚苯乙烯PS和聚氯乙烯PVC的混合物。由于不同组分的dn/dc不同,而软件只能输入一个dn/dc值,所以检测出来的数据必定不那么“绝对”。一个例子就是沥青的分子量检测,其标准方法就是相对分子量,因为成分太复杂了,没法符合光散射的基本要求。
限制3. 荧光样品。具有荧光发射的样品对于散射光信号是一种干扰,如木质素,通常会使得散射光增强,也就是分子量偏高。一个治标不治本的方法是在检测器前加入荧光滤光片,然而,先不谈荧光滤光片会降低检测器的灵敏度,其得到的散射光强也是有偏差的。解决之道是使用RI和粘度检测器连用,进行普适校正,这个后面我们到粘度检测器再慢慢聊。

趣谈4光散射检测器好贵呀,我一定要检测绝对分子量吗?
当然不是。每一种检测方式都有其存在的必然。如果您面对的工作是工厂中的QAQC,或者研发中的初步判断和比较,应该传统校正的相对分子量就够了。但是如果您面对的工作是高端的研发,以及需要分子量和其他物理化学性能相关联,那么绝对分子量无疑会更好。
最近会写一个番外篇,也是一个预告:为什么凝胶渗透色谱需要光散射技术

好了,先聊到这里,开学了,家长和孩子们的惊悚大片即将上映,祝大家心平气和!
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2019/10/12 17:00:06 Last edit by Insm_f06c4b79 举报
小不董
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