主题：【原创】牛奶中四环素类抗生素检测的操作步骤

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月旭

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发表于：2019/10/12 10:46:00 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

牛奶中为什么会出现四环素呢？原来，四环素类抗生素，因为用于奶牛的消炎治疗，然后会有残留，在牛奶中有少量药物的存在。因此，牛奶中的四环素类抗生素的检测显得尤为重要！
月旭科技参照国家标准，对牛奶中的四环素类抗生素进行检测，现将详细操作步骤分享给大家。

1、适用范围:
适用于牛奶中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。

参考标准

《GBT 22990-2008 牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法》

3、原理:
试样中四环素类抗生素残留用 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液 (pH=4.0±0.05)：甲醇 (9:1) 提取，经涡旋和离心后，取上层清液，用月旭公司 BRP 固相萃取柱净化，然后用 HPLC-UV 测定，外标法进行定量。
4、试剂:
试剂1：磷酸氢二钠 0.2mol/L：称取十二水合磷酸氢二钠 71.63g，加水溶解，稀释到 1000mL。
试剂2：柠檬酸 0.1mol/L：称取柠檬酸单水合物 21.04g，加水溶解，稀释到 1000mL。
试剂3：移取 625mL 试剂1 与 1000mL 试剂2，混匀。
试剂4：0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine：称取 60.5g 乙二胺四乙酸(EDTA)二钠盐，用试剂3 溶解并混匀。用 0.1mol/L 的 HCl 或 NaOH，调节 pH 至 4.0±0.05，4℃ 保存。
提取液： Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液：甲醇=(9:1)。
5、提取步骤:
称取 5g 牛奶样品，加入 20mL 提取液，涡旋混合 1min，常温超声 10min，4000r/min 离心 10min，将上清液转移到 50mL 的容量瓶中，再分别用 15mL、10mL 提取液重复上述提取操作，合并上清液，并用提取液定容到 50mL，转移到离心管中，待净化。
6、SPE净化步骤:
SPE柱：月旭 Welchrom® BRP，
规格：200mg/6mL。
a) 活化：5mL 甲醇，5mL 水，弃去。
b) 上样：移取待净化液 5mL，弃去。
c) 淋洗：用 5mL 水淋洗小柱，弃去淋洗液，并抽干小柱。
d) 洗脱：用 2mL 甲醇，稍用负压将小柱湿润，再用 20mL 乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，抽干小柱。
e) 浓缩：将收集的洗脱液在 40℃ 加热条件下氮吹吹干，然后用甲醇复溶并定容到 1mL，并过 0.22μm PTFE 滤膜，上高效液相色谱仪检测。
7、注意事项:

(1) 标准是用 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 进行提取的，但实验效果不佳，后改成 Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液：甲醇=(9:1)。

(2) 在过 SPE 小柱的过程中，“活化”和“上样”这两个步骤要注意不要使得小柱干涸，这样会影响小柱的回收率。而在“淋洗”步骤一定要抽干，因为乙酸乙酯和水是不互溶的。
(3) 加标过程：样品的加标量分别为 2mg/kg，1mg/kg，往 5g 牛奶加入 1mL 10μg/mL 和 0.5mL 10μg/mL 混标溶液，然后用提取液提取，最后用 Na2EDTA-Mallvaine 缓冲液定容至 50mL，准确移取 5mL 上固相萃取柱净化，最终定容到 1mL。
8、色谱条件:
色谱柱：
月旭Ultimate®Plus-C18（4.6 x 250 mm, 5 μm）
流动相：
A:0.01 mol/L 草酸溶液 B:乙腈：甲醇=18:5
洗脱梯度：

流速：1.0mL/min
进样量：10μL
柱温：30oC
检测波长：350nm

9、色谱图或者加标回收率结果：

图1：牛奶样品色谱图

图2：对照品 0.5 μg/mL 色谱图

图3：牛奶样品加标 1mg/kg 图谱

图4：对照品 1 μg/mL 色谱图

图5：牛奶样品加标 2mg/kg 图谱

由表1 可知，采用固相萃取结合高效液相色谱检测四种四环素类药物，加标量为 1.0mg/kg、2.0mg/kg，回收率为 82%~111%，能够满足检测要求。
由图1-5 可看出经 Welchrom® BRP 固相萃取柱净化，采用 Ultimate®Plus-C18 色谱柱检测能够使四种四环素药物得到良好的分离，且各种物质峰形良好，保留时间稳定。
10、相关产品信息：

货号	名称	规格
00522-20014	Welchrom®BRP	200mg/6mL，30pk
00000-30013	15mL螺口尖底离心管	100支/包
00000-30016	50mL螺口尖底离心管	50支/包
00824-31001	Welch 固相萃取装置	12位方缸
00802-02201	针头式过滤器 Nylon	13*0.22 100pk
00824-11101	一次性注射器	200pk/盒带针头橡胶头 1ml
00821-32291	盖子+垫片	预切口红色特氟龙/白色硅胶隔垫，9mm蓝色短螺纹开口盖中心孔6mm
00821-40927	样品瓶	2ml 透明短螺纹广口样品瓶带书写处11.6*32mm 一级水解玻璃
00260-31043	Ultimate®Plus-C18	4.6 x 250 mm, 5 μm
00826-T156P250	盐酸四环素标准品	CAS No.:64-75-5, 250mg
00826-C162P250	盐酸金霉素标准品	CAS No.:64-72-2, 250mg
00826-O024P250	盐酸土霉素标准品	CAS No.:2058-46-0, 250mg
00826-D428P100	盐酸强力霉素(盐酸多西环素)标准品	CAS No.:24390-14-5, 100mg