主题:【第十三届原创】GBT 23381-2009液相色谱法检测豆芽中的6-苄基腺嘌呤

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鹤壁农检联合队发表于:2020/06/01 06:38:58 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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                                        GBT 23381-2009液相色谱法检测豆芽中的6-苄基腺嘌呤

6-苄氨基嘌呤6-BA)是一种人工合成的细胞分裂素,与植物内源激素具有相似的结构和性质,能够抑制植物叶内叶绿素、核酸和蛋白质分解,广泛用作无根豆芽的生长调节剂。它是一种能使豆芽细胞快速分裂的激素类农药,同氮肥一样对人体都有致癌、致畸的作用。超量摄入激素类药品后,会对人体产生一定的危害,如使儿童发育早熟、女性生理发生改变、老年人骨质疏松等等。即使有些危害不会在短时间内出现,但是长久沉积必然会给健康带来不利影响。


试剂:0.02 mol/L醋酸铵水(0.1%乙酸)1.0 L超纯水中加入1.54 g醋铵和1.0 mL冰醋酸,混匀超声,过0.45μm滤膜备用

2.5%甲酸2.5 mL甲酸加入水中,定容至100mL

20%氨水甲醇:20mL氨水加入甲醇定容100mL

20%甲醇水:量取20 mL甲醇、纯水定容100mL,混匀备用

混合型阳离子交换柱;60mg3mL,使用前分别用3mL甲醇、3mL 2.5%甲酸水活化

方法原理

6-苄氨基嘌呤:豆芽样品经粉碎后在酸化的乙腈水溶液提取条件下提取效率高、能消除干扰。高效液相色谱测定,紫外检测器检测,以保留时间定性,峰面积或峰高定量。

前处理条件

样品10.0g至50 mL离心管, 加入20 mL甲醇,超声提取15 min,4000r/min 离心5分钟,上清夜转移至150mL鸡心瓶中,再加入20mL甲醇超声提取15 min,4000r/min 离心5分钟,合并上清液,用旋转蒸发仪40℃减压浓缩(水浴温度不得超过60℃) ,除尽甲醇。残液中加入3滴6 mol/L HCl(残液体积不足2mL时,加入3 mL 2.5%甲酸水),涡旋,高速离心,上清液过用3 mL甲醇、3 mL 2.5%甲酸活化过的PCX小柱净化依次3 mL 2.5%甲酸3 mL甲醇洗涤柱子,再用5 mL 10 %氨水甲醇溶液洗脱收集洗脱液于50℃氮气吹干,20%甲醇水涡旋洗脱定容5.0mL,0.45 um水上机测定。

【说明】:标准中称样量为10.0 g,40 mL甲醇分两次超声提取后,使用C18固相萃取柱净化,甲醇定容,过0.45 um有机膜后上机测定。本文使用阳离子交换柱净化,20%甲醇水洗脱,过水膜后上机测定。

[1] 温度高时,6-苄基腺嘌呤容易发生转化;

[2] 调pH=1.0~2.0,低于6-苄基腺嘌呤pKa(为3.8)两个单位,保证6-苄基腺嘌呤上柱前99%以上处于离子态,保证回收;减压浓缩除尽甲醇后,剩余液体的体积大于4 mL,可以不加3 mL 2.5%甲酸水,直接使用6 mol/L HCl调节酸性后,高速离心,上柱净化;

[3]高速离心,沉淀非水溶性固体,溶液澄清后提高过柱速度;

[4]使用5%氨水甲醇5 mL洗脱,阳离子交换柱上有残留,回收低;

[5]若使用有机滤膜会引入吸收波长为247nm的干扰峰。

[6]干样称2 g,加8 mL水,提取、净化步骤同新鲜样品,使用5%氨水甲醇3 mL洗脱,收集洗脱液,于50℃氮气吹干,20%甲醇水洗脱,定容1.0 mL。

[7]因流动相中含有0.1%乙酸,仪器要平衡足够长时间(待基线完全直线,一般一个小时以上)

仪器分析条件

1色谱的选择

6-苄氨基嘌呤在甲醇和乙腈等有机试剂中有较好的溶解度,用这些试剂提取再配合液相色谱仪,可大大简化前处理过程,缩短前处理时间,且高效液相色谱仪应用较为普遍,其易于推广应用,实用性强。

2色谱的优化

实验过程中通过对色谱条件规定的参数要求进行了多次调整,以使仪器的灵敏度、稳定性和分离效率均处于最佳状态,获得满意的分离效果,达到回收率的要求。经过多次的试验摸索,确定实验参数。

(1)色谱柱的选择

选用C18色谱柱,该色谱柱可在宽pH 范围(pH 2-9) 内提供良好的峰形,实验证明,该色谱柱适合分离豆芽中的6-苄氨基嘌呤峰形完全能满足检测要求且与干扰物质进行有效分离。

(2) 色谱条件的选择

通过对0.5mg/L6-苄氨基嘌呤的甲醇溶液并以甲醇为参比进行200-400 nm范围的紫外扫描,结果发现,6-苄氨基嘌呤267nm处有最大吸收,因此紫外吸收波长确定为267nm


                             

                                                                              6-苄氨基嘌呤光谱图


(3)仪器的工作条件为:

仪器型号:WATERS  2695色谱柱: C18/250*4.6mm

检测器:PDA 267 nm进样量:10μL;流速:1.0mL/min柱  温:35 ℃

流动相:梯度洗脱    B:甲醇; A:0.02 mol/L醋酸铵乙酸水(0.1%乙酸)





(4) 液相色谱法线性范围

6-苄氨基嘌呤标准系列工作液浓度分别为0.10 mg/L、0.2 mg/L、0.5mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L、将各浓度按照建立的方法依次进样后,检测得出一系列峰面积与浓度的对应点,连点成线,得到拟合标准曲线,直线方程为Y=0.9013X-0.0051,相关系数r=1.0000。可见在0.1~2mg/L浓度范围内线性很好。如果实测样品的含量超过此范围,可对其进行稀释。

方法检出限:取豆芽样品,加标浓度为0.05mg/kg,S/N值为6.2。





                                        样品检出限色谱图


方法的回收率

分别以黄豆芽和绿豆芽为加标对象,分别加入2个水平的6-苄氨基嘌呤标准溶液,进行回收率的测定,每个样品重复6次,计算出每个添加水平的回收率和相应的相对标准偏


差(RSD)值。方法回收率结果见表1。

                           


                           

                                 


                                                        样品加标0.1mg/kg堆栈难色谱图

                                 

                                                            样品加标0.25mg/kg堆栈难色谱图


          6-苄氨基嘌呤属五大类植物激素中的细胞激动素类,其主要功能为促进非分化组织分化,促进生物体内物质的积累,促进侧芽发生,防止老化等作用,因此被广泛应用于农业、果树和园艺作物从发芽到收获的各个阶段。因此,有所检出可能为豆子本身的残留,而非人为添加。

结论:

【说明】:1、标准中称样量为10.0 g,40 mL甲醇分两次超声提取后,使用C18固相萃取柱净化,甲醇定容,过0.45 um有机膜后上机测定。本文使用阳离子交换柱净化,20%甲醇水洗脱,过水膜后上机测定。

2、 温度高时,6-苄基腺嘌呤容易发生转化;

3、 调pH=1.0~2.0,低于6-苄基腺嘌呤pKa(为3.8)两个单位,保证6-苄基腺嘌呤上柱前99%以上处于离子态,保证回收;减压浓缩除尽甲醇后,剩余液体的体积大于4 mL,可以不加3 mL 2.5%甲酸水,直接使用6 mol/L HCl调节酸性后,高速离心,上柱净化;

4、高速离心,沉淀非水溶性固体,溶液澄清后提高过柱速度;

5、使用5%氨水甲醇5 mL洗脱,阳离子交换柱上有残留,回收低;

6、若使用有机滤膜会引入吸收波长为247nm的干扰峰。

7、干样称2 g,加8 mL水,提取、净化步骤同新鲜样品,使用5%氨水甲醇3 mL洗脱,收集洗脱液,于50℃氮气吹干,20%甲醇水洗脱,定容1.0 mL。

8、因流动相中含有0.1%乙酸,仪器要平衡足够长时间(待基线完全直线,一般一个小时以上)
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前面那几个高峰是什么?这么多注意事项,看来做这个试验时,楼主付出很多。
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豆芽的检测,的确比较复杂,很多激素类物质。
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