四. 逆流色谱技术的新进展
1.梯度洗脱逆流色谱:高速逆流色谱通常使用恒定比例的溶剂系统,但是对于组分极性变化大的样品,用
恒定比例的溶剂系统难以达到分离效果。此时可以像HPLC一样采用梯度洗脱的方法进行分离。先用简单的
梯度洗脱系统如水-乙腈(100:0O:100)用HPLC对样品进行极性扫描分析,选择适当的溶剂系统,如正
己烷-正丁醇-甲醇-水(极性化合物);正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(中极性化合物)和正己烷-乙腈(非
极性化合物),然后逐渐改变系统中某一溶剂的比例,如将正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系中甲醇的比例
从0.1逐渐提高到2.5并求出不同甲醇比例时的分配系数以优化溶剂系统,最终得出最佳梯度洗脱系统。花
色素苷 (anthocyanins)是一种类黄酮类植物色素,是很好的抗氧化剂和自由基清除剂。由于结构中羟基
和糖苷基的数目不同而使各组分的极性不同。以乙酸乙酯-正丁醇-水(0.2%TFA)为溶剂系统,采用逐渐提
高流动相中正丁醇比例的方法对样品进行梯度洗脱逆流色谱,一次既可分离出5个活性成分。
2. pH区带逆流色谱:pH区带逆流色谱(pH-zone-refining CCC)的洗脱色谱图形与顶替色谱和等速电泳相
似,主要组分的峰组成一系列矩形色谱峰,各色谱峰之间很少重叠,一般针对可离子化的分子如羧酸、胺
等。操作时选择两相体系如甲基叔丁基醚-水,平衡后取上层溶剂加入适量的作为“保留剂”的酸如三氟
乙酸并作为固定相,下层溶剂加入适量的作为“取代剂”的碱如氨水并作为流动相。以分离有机酸R1COOH
、R2COOH、R3COOH(pKa1《pKa2《pKa3)为例,首先将酸化的固定相注入色谱柱中,然后加入用固定相溶
解的样品。泵入流动相后,在色谱柱足够长的情况下整个体系达到“等速”状态,与氨水界面移动的速度
同步。酸性较强的R1COOH先与氨水作用,转化为R1COO-和NH4+,但R1COO-随即被酸性更强的CF3COOH质子
化,又变为R1COOH回到固定相,CF3COO-和NH4+先洗脱出。同样,在CF3COOH消耗完变为CF3COO-后,
R1COOH提供质子,使R2COO-转化为R1COOH留在固定相,直至所有的R1COOH转变为R1COO-,并随流动相洗脱
出,形成R1COO-的矩形色谱峰。与此类推,其次洗脱出的是R2COO-矩形峰,最后是R3COO-的矩形峰。由于
在所有的R1COOH转变为R1COO-前,R2COO-不会洗脱出,因此,R1COO-在色谱图上形成矩形峰,与R2COO-很
少重叠,R2COO-和R3COO-的峰也是如此。
同样,若被分离的样品是碱类如生物碱等,也可以碱为保留剂,酸为取代剂,进行pH区带逆流色谱分离。
此外,也可以选择下相溶剂为固定相,上相溶剂为流动相,因此,pH区带逆流色谱扩大了逆流色谱的应用
范围,提高了样品的进样量,可进行制备性的样品分离,在氨基酸及其衍生物、多肽、氧杂葱染料、生物
碱、多酚和异黄酮类等化合物的分离方面得到应用。如用正丁醇-0.03mol三氟乙酸(1:1)分离了粘菌素;
用正丁醇-0.2mol甲酸氨分离了缩胆囊素。pH区带逆流色谱也可以用于有机酸对映体的分离,如下图中1-
甲基-4-甲氧甲基环己基甲酸的两个异构体由于立体位阻效应不同而使酸性产生差异,从而得到分离。
3. 离子交换顶替离心分配色谱: 离子交换顶替离心分配色谱(Ion-exchange displacement CPC)的原理与
pH区带逆流色谱相同,但后者针对可离子化的分子如羧酸和胺类,而前者特指离子化的化合物即在任何pH
值的情况下都带电的化合物如有机磺酸盐和季胺盐等。从褐色海藻中提取出一种多取代硫酸多糖,以硫酸
岩藻糖为基本单元的聚合体上还含有半乳糖、木糖和糖醛酸。这种带多个负电荷的高极性聚合物(Fn-,
Fn-1-, F2-, F1-等)易溶于水,不适合用离心分配色谱等进行分离,但引入离子交换顶替方法后可以用
CPC等逆流色谱予以分离。操作中采用了一种
液相离子交换树脂Amberlite LA2,这是一种高分子油溶性二
级胺,在大部分有机溶剂中溶解性良好而在水相中溶解性极低。将LA2溶解在甲基异丁基酮等有机溶剂中
并用盐酸质子化,将有机相作为固定相,样品用固定相溶解后注入色谱柱,以含OH-的溶液为流动相进行
离子交换顶替离心分配色谱分离,其分离原理与pH区带逆流色谱相同,最终被树脂吸附最弱的多糖先洗脱
出,最后出来的是吸附最强的组分。
4. 手性分离逆流色谱: 手性分离技术已经在高压
液相(HPLC)、
气相(GC)和毛细管电泳(CE)中得到广泛
应用,但在逆流色谱中应用很少。主要困难在于寻找适合的手性选择剂,它们在
液相和混合溶剂中都要有
很高的选择性,并且能将所要分离的手性异构体洗脱出。尽管进展不大,但下列开拓性的工作值得重视:
源自HPLC技术的以N-十二烷酰-L-脯氨酰-3,5-二甲基苯胺和万古霉素为手性选择剂的工作以及源自CE技术
的以-环糊精为手性选择剂的工作。
N-十二烷酰-L-脯氨酰-3,5-二甲基苯胺是电子供体化合物,能将天然氨基酸的N-(3,5-二硝基苯甲酰
基)-叔丁基衍生物(DNB-氨基酸)的对映体快速和完全分离。研究发现若增加固定相中手性选择剂的量或
浓度以及调整溶剂系统的憎水性使对映体的分配系数在0.6和0.8之间(pH区带逆流色谱除外)的话,可以
在330mL的色谱柱中用CCC仪器将1克的DNB-氨基酸外消旋体分离,采用pH区带逆流色谱,分离量可达2克。
(3R,4R)-7-des-methyl-ormeloxifene是部分雌激素受体激动剂(-)-(3R,4R)-levormeloxifene的主要体内
代谢产物,对(3R,4R)-7-des-methyl-ormeloxifene及其(3S,4S)的对映体进行毛细管电泳分离时,以硫酸
化-环糊精为手性选择剂,分离度可增加十倍,达到100以上。但毛细管电泳的分离量太少,于是,将此
技术应用于逆流色谱,选择取代度为7到11的硫酸化-环糊精为手性选择剂,以10:1:9的乙酸乙酯—甲醇
—三乙铵乙酸盐溶液为溶剂系统并在固定相中加入2%(W/V)的硫酸化-环糊精,可很好地将上述对映体拆
分。
万古霉素作为一种通用和高效的手性选择剂已应用于
液相色谱、薄层色谱和毛细管电泳,并成功地拆分了
许多对映体如氯杀鼠灵、华法林、萘氧丙草胺、5-甲基-5-苯基乙内酰脲和各种氨基酸衍生物。万古霉素
易溶于水,在甲醇中也有一定的溶解度,但不溶于高级醇和其它较低极性的有机溶剂。因此,以万古霉素
为手性选择剂进行CCC和CPC拆分时,通常采用两相系统:含万古霉素的水相固定相和富含对映体的低极性
的有机流动相。这样,分配系数K值在0.5到1之间,有利于快速回收。采用甲苯和140mg/ml万古霉素溶液
(pH4.7)组成的两相系统,分别以CCC仪器(13mL 分离柱)和CPC仪器(90mL分离柱)对正亮氨酸的丹磺酰
衍生物进行对映体拆分。由于D对映体倾向于保留在万古霉素溶
液相中,而L对映体倾向于保留在有机相中
,因此,D,L对映体与作为固定相的万古霉素溶液一起注入,当L对映体随有机流动相洗脱出后,以有机相
为固定相,万古霉素溶
液相为流动相,将D对映体洗脱出,达到拆分目的。使用CPC仪器,在50分钟内可将
50毫克的对映体拆分开。
虽然上述逆流色谱新技术的应用与其它色谱新技术相比,还有待于普及和推广,特别是在抗生素分离纯化
方面,更显得薄弱不足。希望抗生素界的广大同行一起努力,学习、应用和推广逆流色谱这一分离技术,
使它在抗生素行业异军突起,生根发芽,发挥它应有的作用。
致谢:本所方东升工程师在本文的写作过程中给予许多帮助,并在高速逆流色谱分离环孢菌素混合物中做
了具体工作,特此致谢。