主题：【第十三届原创】二维液相色谱法的杂质分析

二维液相色谱法的杂质分析

一、 目的：

利用二维液相色谱法对氟氯西林钠的聚合物杂质进行定性分析，确定凝胶色谱分离的第一个杂质峰与有关物质分析方法（反向色谱分析）中的得到第一个杂质峰为同一个物质。

二、实验仪器：

电子天平    型号：T-214 

pH计      型号： PB-10

液相色谱仪  型号：U3000 （双三元 高压泵 柱温箱附带十通切换阀）

100 μl定量环

三、 实验用试剂：

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、、磷酸二氢钾、磷酸、甲醇、乙腈、实验用水（mili-Q）

四、 实验样品：

氟氯西林钠（制剂提供）

五、 色谱条件：

1、 右泵  （凝胶色谱）

色谱柱：Tsk G2000SW XL（7.8mm*300mm;  5μm）

流动相：0.04mol/l磷酸二氢钠-0.04mol/l磷酸氢二钠（61:39）pH=5.0：乙腈（95:5）

VWD检测器波长：215nm  进样量：20μl  流速：0.8ml/min  柱温：25℃

2、 左泵  （反向色谱）

色谱柱：Agela  Venusil  MP C18 （4.6mm*250mm;  5μm）

流动相A：乙腈 -2.7g/磷酸二氢钾溶液（pH=5.0）=20:80

流动相B：乙腈 -2.7g/磷酸二氢钾溶液（pH=5.0）=40:60

按下表程序梯度洗脱：

六、 实验过程：

1、 首相使用右泵接凝胶色谱柱测得聚合物色谱图，由此色谱图计算确定二维反相色谱的阀切换时间。

由图可知：第一个杂质峰的保留时间为16.517min 流速0.8ml  截取100μl 所用的时间就等于1/8=0.125min,所以初步确定阀切换时间为：16.517-0.125=16.392min.

2、 使用左泵的反相系统色谱条件测得杂质的保留时间为：4.301min见下图

3、 编辑采集方法1设置阀切换时间为16.392min，编辑程序关键点如下图：

起始阀的位置是10 —1，在第二行追加命令为16.392min阀的位置切换至1 —2。左泵、右泵同时运行，当右运行至16.392min时阀切换至1 — 2，截取通过凝胶色谱分析的聚合物100μl 至反相色谱系统中，依左泵程序梯度洗脱。得到相对保留时间一致的杂质峰。

10 ---1右泵连接示意图

        1——2左泵管路示意图

利用药瓶盖二维并联连接管路示意图

                                                            二维色谱图 

七、结论：二维液相色谱杂质色谱图表留时间为21.796min-16.392=5.0404min，相对保留时间在可接受范围内。

注意事项：

1、熟悉仪器管路基本连接，明确实验目的。

改装后的并接流路图，白色的为新增加的定量环。

3、 阀切换的时间确定一定要以实验数据为依据，可截取聚合物保留时间的前后两端时间，来确定最终的阀切换时间。

修改后的采集方法左泵反相梯度洗脱应该适当调整，以本次实验为例最终采集时间延长16min，编辑采集方法时要确定

阀切换的位置和时间。

4、 右泵凝胶色谱流路，采集时间延长至81min。

5、 调整后的左泵梯度洗脱程序如下：