主题:【第十三届原创】【刷新认知篇】HPLC方法重现保留时间相差10min

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1. 背景

在研发分析实验室中,主物质保留时间在38min左右,而QC实验室中,主物质保留时间在28min~30min。,不同实验室方法重现主物质保留时间相差10min,故进行调查。

2. 色谱参数

波长:200nm

柱温:30℃

运行时间:90min

流速:0.4mL/min

进样量:10μL

色谱柱:Welch AQ-C18 300mm*3.03μm

缓冲液:20mM磷酸二氢钠,磷酸调节pH=2.50

稀释剂:50mM磷酸二氢钠,磷酸调节pH=2.50

梯度:

Time(min)

MPA(%)

MPB(%)

0

80

20

10

80

20

40

76

24

50

60

40

65

25

75

75

25

75

75.1

80

20

90

80

20

样品浓度:5mg/mL

3. 调查实验

3.1试剂调查

分别调查了不同批号和厂家试剂对该物质保留时间的影响,实验结果见下表:

序号

变量

结果

1

研发磷酸与QC磷酸对比

主物质RT均为38min左右

2

研发磷酸二氢钠和QC磷酸二氢钠对比

主物质RT均为38min左右

3

无水磷酸二氢钠和二水合磷酸二氢钠对比

主物质RT均为38min左右

结论:试剂品牌和批号对主物质保留时间无影响。

3.2流动相耐用性考察

分别考察了pH和缓冲盐浓度对主物质保留时间的影响

序号

变量

结果

1

缓冲液pH2.48-2.52

主物质RT均为38min左右

2

缓冲液盐浓度15mM20mM对比

主物质RT均为38min左右

结论:pH和缓冲盐浓度对主物质保留时间无影响。

3.3色谱柱考察

更换同一型号(PN完全一致),序列号不同的色谱柱进行实验

序号

变量

结果

1

同型号不同色谱柱对比

主物质RT均为38min左右

结论:色谱柱对主物质保留时间无影响。

3.4鬼峰捕集小柱考察

卸掉鬼峰捕集小柱考察主物质保留时间的影响

序号

变量

结果

1

有无鬼峰柱对比

主物质RT均为38min左右

结论:鬼峰捕集小柱对主物质保留时间无影响。

3.5仪器考察

考察不同的仪器对主物质保留时间的影响

序号

变量

结果

1

LC06(原仪器)

主物质RT38min左右

2

LC07

主物质RT38min左右

3

LC08

主物质RT28min左右

4

LC09

主物质RT28min左右



分析:LC06LC07实验结果一致,LC08LC09实验结果一致(和QC实验室结果一致)。

LC06LC07Agilent 1260 Infinity IILC08LC09Agilent 1260 Infinity

结论:导致主物质保留时间差异的可能是仪器型号差别引起的

典型图谱

LC06LC07主物质RT=38min左右的图谱:

LC08LC09主物质RT28min左右的图谱

4. 补充实验流速校准

排查LC06LC07仪器1个月以前刚换新的比例阀,其他项目保留时间都正常,并且连续打6针主物质保留时间不漂移。所以排除比例阀因素低流速的项目这两台仪器很少做需校准一下0.4mL/min仪器流速是否准确

LC06LC07流速校准表格如下:

PS由于方法中用的是AC通道,流速准确,对结果不会有影响。

结论以上两台仪器流速不是造成保留时间相差10分钟的主要原因

5. 结果推测

LC06LC07仪器为Agilent 1260 Infinity II仪器,而LC08LC09Agilent 1260 Infinity仪器QC采用waters仪器分析的结果和Agilent 1260 Infinity结果一致引起此次保留时间相差10分钟的主要原因为仪器型号差别造成

6. 问题解决

6.1问题咨询调研

以上问题咨询了安捷伦工厂德国工厂),就此问题厂家也给了一个测试实验结果及相关建议

测试结果

结论从以上实验结果可以看出Agilent 1260 InfinityAgilent 1260 InfinityII历史软件版本H.07.24)和Agilent 1260 InfinityII新软件版本D.07.24)保留时间不同(保留时间越大的,保留时间差距也会越大)。Agilent 1260 InfinityAgilent 1260 InfinityII历史软件版本H.07.24)两者保留时间更加接近一点。

解决方案:Agilent 1260 InfinityII新软件版本D)泵版块激活历史版本变成H这样Agilent 1260 InfinityAgilent 1260 InfinityII保留时间差距会减小。

6.2解决方案验证

6.2.1使用诊断软件,打开泵设置模块,点击激活“历史版本模式”

6.2.2检查是否激活成功确保版本D变成H

6.2.3激活历史版本后同样的色谱条件用Agilent 1260 InfinityIIH.07.28再次做上述项目图谱如下

结果经过历史版本激活后主物质保留时间为30.2minAgilent 1260 InfinityQCwaters仪器几乎一致

7. 总结篇

流动相组成百分比很低(5%以下一个通道)或非常梯度(2% /分钟或更少),保留时间越大的不同仪器型号差别会很大。本项目造成保留时间相差10min的主要原因是梯度缓0.13%/分钟)。

低比例流动相和缓梯度仪器的精度要求很高这也是安捷伦一直在攻克的技术难题。通不断优化电磁阀控制柱塞杆推动频率比例阀的开合频率等综合因素算法来实现精度更精确

鸣谢感谢小豹同事对整个调查的支持感谢安捷伦工厂给的建议

申明:本文为个人经验分享仅代表个人观点,仅供参考,欢迎交流!

        End       

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很好的问题解决思路。不过这个问题也确实难了点。楼主有心了
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原文由 m3336169(m3336169) 发表:很好的问题解决思路。不过这个问题也确实难了点。楼主有心了
这个问题前后解决花了一个多月,希望能给大家一点新的东西,常交流哈!
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原文由 p3257969(p3257969) 发表:受教了!
过程还是蛮曲折的,希望能为您增添一点点新知识,常交流哈!
m3336169
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原文由 viki(Insm_df8bf4f4) 发表:这个问题前后解决花了一个多月,希望能给大家一点新的东西,常交流哈!
确实够折腾的。很好的思路,液相的问题还是比气相复杂的太多了
xx_dxd_xx
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楼主很仔细,搞清楚了问题,很难得。
不过我觉得这个方法也存在不合适的地方,这么小的梯度变化是否有必要?从稳定性的角度看,能用等等的尽量不用梯度
mouguangyin
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好厉害,软件版本的不同带来出峰时间的差异都可以分辨出来
zyl3367898
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软件版本不同会影响主峰保留时间 学习了 谢谢分享