主题：【第十三届原创】离子色谱法同时测定尿液中磷酸盐和草酸

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9月一等奖

离子色谱法同时测定尿液中磷酸盐和草酸

黄选忠

（湖北兴山县疾病预防控制中心，湖北兴山,443711）

摘要：【目的】建立以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱，离子色谱法同时测定尿样中磷酸盐和草酸的新方法。【方法】研究用离子色谱法同时测定尿液中磷酸盐和草酸的色谱条件，通过试验优化确定了各项色谱条件。【结果】以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱，以6.0mmol/LNa₂CO₃-2.0mmol/LNaHCO₃为淋洗液，流量为1.0mL/min，等度洗脱可将磷酸盐和草酸与尿液中大量共存的氯化物、硝酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全分离，通过抑制电导检测，磷酸盐含量分别在0.20～20.0mg/L、20.0～100.0mg/L，草酸的含量分别在0.05～5.0mg/L、5.0～25.0mg/L范围内与其峰高和峰面积呈良好的线性关系（相关系数r在0.9995～0.9998），方法应用于尿液中磷酸盐和草酸的同时测定，加标回收率分别为94.5%～104.7%和96.0～104.2%， 5次平行测定的相对标准偏差（RSD）小于3%（n=5）。【结论】本方法可用于尿液中磷酸盐和草酸的同时测定。

关键词：离子色谱法；尿液；硫氰酸盐；草酸；

中图分类号：O652.63 文献标识码：文章编号：

泌尿系结石是临床上的常见病和多发病。其中纯草酸钙结石占85%以上，草酸钙+磷酸钙结石占10%以上^[1]。草酸代谢异常所引起的高含量草酸尿是泌尿系结石形成的主要原因^[2]。因此准确测定尿液中磷酸盐和草酸含量对研究结石形成机理、结石的鉴别等均具有重要意义。目前尿液中的磷酸盐（无机磷）的测定在《全国临床检验操作规程》中推荐的方法包括磷钼杂多酸紫外光度法和以硫酸亚铁或对甲氨基酚硫酸盐为还原剂的钼兰光度法^[3]，文献用氨基奈酚磺酸为还原剂的钼兰光度法^[4]测定尿磷，这些方法中紫外光度法存在干扰因素多，选择性差，而钼兰光度法则存在稳定性较差操作繁杂之缺憾。尿液中草酸的测定方法主要有光度法包括络合物褪色比色法^[5]和催化光度法^[6]、催化荧光法^[7]、高效液相色谱法^[8]和毛细管电泳法^[9]等，而比色法、光度法、荧光法等方法特异性差，样品前处理繁杂，高效液相色谱法和毛细管电泳法因需要专用仪器而使其应用受到限制。离子色谱法以其操作简便、样品无须特殊处理、易实现自动化和可多组分同时测定的优势现已成为无机阴离子和有机酸测定的首选方法，并成功应用于尿液中草酸^[10]的测定和草酸、磷酸根及枸橼酸的同时测定^[11]，但这类方法大多使用的是进口仪器并采用梯度洗脱的方式进行使其应用受限。本工作利用国产盛瀚CIC-100型离子色谱仪和SH-AC-3型阴离子交换柱，以6.0mmol/LNa₂CO₃-2.0mmol/L NaHCO₃溶液为淋洗液， 1.0mL/min的流量等度洗脱，离子色谱-抑制电导检测法同时测定尿液中磷酸盐和草酸的新方法，磷酸盐含量分别在0.20～20.0mg/L、20.0～100.0mg/L，草酸的含量分别在0.05～5.0mg/L、5.0～25.0mg/L范围内与其峰高和峰面积呈良好的线性关系（相关系数r在0.9995～0.9998），方法应用于尿液中磷酸盐和草酸的同时测定，加标回收率分别为：94.5%～104.7%和96.0～104.2%，5次平行测定的相对标准偏差（RSD）在0.85%～2.07%，以3倍信噪比（3N/b）计，磷酸盐和草酸最低检出浓度分别为0.10mg/L和0.04mg/L。

1、试验部分

1.1主要仪器

CIC-100型离子色谱仪（青岛盛瀚色谱公司，编号15601），抑制器：自再生抑制器，检测器：电导检测器，定量环体积为25μL；SHA—15自动进样器（青岛盛瀚色谱公司，编号AS1518050）；SH-AC-3型阴离子交换柱（250×4.0mm i.d,青岛盛瀚色谱公司，批号：1602037）；SH-AC-3型保护柱（50×4.0mm i.d,青岛盛瀚色谱公司，批号：1602037）。

1.2仪器工作条件及参数设置

色谱仪：柱箱温度35℃，电流：75mA，量程：1档。

自动进样器：全定量环取样，取样后清洗（每针之间），置换量70μL，取样量25μL，扎针深度4mm。

1.3主要试剂

草酸标准溶液：1000 mg/L，称取优级纯草酸（H₂C₂O₄·2H₂O）0.1401g用超纯水溶解，转入100mL容量瓶加水至刻度；H₂PO₄^-标准溶液：1000mg/L，称取分析纯磷酸二氢钾0.1402g用超纯水溶解，转入100mL容量瓶加水至刻度。

用前将各种标准溶液用纯水分别稀释成含H₂PO₄^-和草酸分别为20.0mg/L和5.0mg/L（A液）、H₂PO₄^-和草酸分别为200.0mg/L和50.0mg/L（B液）混合标准应用液备用。

无水碳酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），草酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司），磷酸二氢钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

试验所用其他试剂均为AR级，试验用水为超纯水（18.2ΜΩ·cm）。

1.4试验方法

1.4.1标准曲线的绘制取混合标准应用液（A液）0.10、0.20、0.40、1.0和2.00mL及B液1.0、2.0、4.0和5.00mL于10mL容量瓶中加纯水至刻度，混匀，配制成含H₂PO₄^-0.20～100.0 mg/L、草酸为0.05～25.0 mg/L的标准系列，各管取1.5mL于样品瓶中，启动自动进样器进样分别测定各组分的峰面积（S）和峰高（H），以S及H对各组分浓度(C)绘制工作曲线。

1.4.2尿样的采集用清洗干净并干燥的聚乙烯瓶采集尿样50mL储存于4℃冰箱待测定。

1.4.3尿样测定取新鲜尿样经8000转/min离心10min，取上清液用高纯水稀释50或100倍后分别用C18柱净化、用0.22μm滤膜过滤后取1.5mL于样品瓶中，启动自动进样器进样测定各组分的S和H，以标准曲线法定量，同时进行加标回收试验。

2、结果与讨论

2.1色谱条件的选择

2.1.1淋洗液浓度的选择试验结果表明，当以Na₂CO₃+NaHCO₃溶液为淋洗液,其浓度在6 mmol/L+1 mmol/L～6 mmol/L+3 mmol/L范围内，SH-AC-3型阴离子交换柱均可将磷酸盐（以H₂PO₄^-计，在本试验条件下，H₂PO₄^-和HPO₄^2-和并为一个峰，实际上H₂PO₄^-已转化成HPO₄^2-）与硝酸盐和硫酸盐、草酸与硫酸盐和硫氰酸盐等常见阴离子完全分离，各组分的分离度（R，相对于后续组分，如磷酸盐的R是相对于硫酸盐的，下同）在1.50～6.49，满足相邻两峰完全分离（R=1.5）的标准^[12]，试验选择6.0mmol/LNa₂CO₃-2.0mmol/L NaHCO₃溶液为淋洗液，试验结果见表1。

表1 Na₂CO₃+NaHCO₃溶液浓度（mmol/L）选择试验结果（流量1.0 ml/min）

组分	6.0mmol/L+1.0mmol/L		6.0mmol/L+2.0mmol/L		6.0mmol/L+3.0mmol/L
组分	T/min	R	T/min	R	T/min	R
H₂PO₄^-	11.561	1.50	10.991	2.59	10.688	2.83
SO₄^2-	12.778	4.13	13.144	4.29	13.054	4.28
草酸	16.797	6.14	17.271	6.49	17.098	6.46
SCN^-	24.891	/	24.927	/	25.337	/

2.1.2淋洗液流量的选择对于一定的淋洗液，不同的流量将使组分的保留时间（T）和分离度将发生变化。试验结果表明，当淋洗液流量从0.8mL/min增加至1.2mL/min时，各组分的保留时间逐渐缩短，分离度逐渐变小，但磷酸盐和草酸的分离度远大于1.5，表明相邻两组分已完全分离，见表2。在保证待测组分与干扰离子完全分离的前提下尽量使用较低的流量，以降低系统压力延长泵的使用寿命，故淋洗液流量选定为1.0mL/min。

表2 淋洗液流量选择试验结果（6.0mmol/LNa₂CO₃-2.0mmol/LNaHCO₃）

组分	0.8ml/min		1.0ml/min		1.2ml/min
组分	T/min	R	T/min	R	T/min	R
H₂PO₄^-	13.543	2.75	10.969	2.63	9.151	2.57
SO₄^2-	16.282	4.50	13.178	4.30	10.995	4.24
草酸	21.338	6.64	17.320	6.52	14.480	6.48
SCN^-	30.636	/	25.047	/	21.175	/

2.1.3色谱柱的选择在6.0mmol/LNa₂CO₃-2.0mmol/LNaHCO₃溶液流量1.0mL/min洗脱条件下，考察了青岛盛翰色谱公司生产的SH-AC-1型和SH-AC-3型阴离子交换柱对磷酸盐与硝酸盐和硫酸盐、草酸与硫酸盐和硫氰酸盐等常见阴离子的分离情况，结果表明，在此条件下SH-AC-1型柱对磷酸盐与硝酸盐和硫酸盐、草酸与硫酸盐的分离效果比SH-AC-3型柱要差，各组分分离度明显偏低，故本试验选择SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱。

2.1.4柱箱温度的确定考察了柱温在30℃、35℃和40℃时各组分的分离效果，结果显示，在30℃～40℃范围内，磷酸盐与硝酸盐、硫酸盐，草酸与硫酸盐、硫氰酸盐等阴离子完全分离，且随着柱温的升高组分的保留时间稍微缩短，分离度逐渐下降，但均在1.5以上，在保证适宜的保留时间和较高的分离度的前提下，尽量采用较低的柱温，本试验确定柱箱温度为35℃。

2.2标准曲线

按照1.4.1配制标准系列，测定各管的峰面积（S）和峰高（H），以S、H对浓度（C）绘制标准曲线，其标准曲线的试验结果列于表3。从表3可见，H₂PO₄^-分别在0.20～20.0mg/L和20.0～100.0mg/L范围内与峰面积和峰高均呈良好的线性关系，相关系数r在0.9995～0.9997，但在0.20～100.0mg/L范围内则线性较差，以峰面积和峰高计相关系数r仅为0.9990和0.9983。草酸则分别在0.05～5.0mg/L和5.0～25.0mg/L 范围内与峰面积和峰高均呈良好的线性关系，相关系数r在0.9994～0.9998，在0.05～25.0mg/L 范围内时则线性较差，但相关系数r仍达0.9995和0.9991，能满足分析方法的相关要求。同时在计算测定结果时均可分别用峰面积和峰高计，并应根据样品浓度范围采用分段计算的方式计算结果，以减少测量误差，尤其对低含量的样品。其中，含20.0mg/L的H₂PO₄^-和5.0mg/L的草酸标准溶液色谱图见图1。

表3 标准曲线试验结果

组分	以峰面积计			以峰高计
组分	线性范围/mg/L	回归方程	相关系数/r	回归方程	相关系数/r
H₂PO₄^-	0.20～20.0	S=54739.17C-13358.36	0.99973	H=1778.29C-410.68	0.99959
	20.0～100.0	S=70195.33C-375912.30	0.99975	H=2457.32C-16524.20	0.99951
	0.20～100.0	S=66382.29C-82677.80	0.99902	H=2287.74C-3482.42	0.99833
草酸	0.05～5.0	S=100896.10C-4446.88	0.99952	H=2475.41C-94.43	0.99947
	5.0～25.0	S=115321.78C-25752.87	0.99951	H=3130.88C-3837.95	0.99982
	0.05～25.0	S=116032.36C-39070.40	0.99953	H=2973.73C-818.44	0.99917

2.3方法的精密度和检出限

对高、低浓度的标准溶液各平行测定5次，计算磷酸盐和草酸峰面积的RSD，同时测定仪器30min的基线噪声，以3倍基线噪声除以标准曲线（峰面积计）的斜率（3N/b）计算磷

图1 标准溶液色谱法图

酸盐和草酸的检出限，5次平行测定的RSD在0.85%～2.07%，方法的重复性良好，磷酸盐和草酸的最低检出浓度分别为0.10mg/L和0.04 mg/L，若以尿样稀释50倍计，则磷酸盐和草酸的检出限分别为5.0mg/L和2.0 mg/L，见表4。

表4 方法的精密度和检出限

组分	标液1			标液2			检出限/mg/L
组分	浓度/mg/L	平均峰面积	RSD/%	浓度/mg/L	平均峰面积	RSD/%	检出限/mg/L
H₂PO₄^-	4.0	201934.4	2.07	20.0	1083821.5	1.38	0.10
草酸	1.0	98277.4	1.45	5.0	500710.4	0.85	0.04

2.4 共存阴离子的影响

在本试验条件下，磷酸盐和草酸与常见阴离子的色谱图见图2，从图2可见，目标组分与常见阴离子能完全分离。但尿液中含有大量的有机物和氯化物、硝酸盐和硫酸盐等阴离子，

图2 磷酸盐、草酸与常见阴离子分离色谱图

当尿样经50或100倍稀释后可降低氯化物、硝酸盐和硫酸盐等阴离子的影响，经过C18柱的净化可以消除有机物的干扰。试验特别考察了氯化物、硝酸盐和硫酸盐对磷酸盐和草酸测定结果的影响，结果表明，500mg/L Cl^-、300mg/L NO₃^-、200mg/L SO₄^-2对4.0mg/L磷酸盐和1.0mg/L草酸的测定结果无明显影响（测量误差在±5%范围内），分离色谱图见图3，说明方法有较好抗干扰能力。

图3 磷酸盐、草酸与500mg/L Cl^-、300mg/L NO₃^-、200mg/L SO₄^-2分离色谱图

2.5尿样测定及回收率试验结果

按试验方法1.4.3的步骤对尿样进行处理后取1.5mL样液于样品瓶中，启动自动进样器进样测定各组分的峰面积（S）和峰高（H），以标准曲线法定量，同时进行加标回收试验。3

表5 尿样（稀释50倍）测定及回收率试验结果（以峰面积计）

组分	尿样1			尿样2			尿样3
组分	本底/mg/L	加入量 /mg/L	回收率 /%	本底 /mg/L	加入量 /mg/L	回收率 /%	本底 /mg/L	加入量 /mg/L	回收率 /%
H₂PO₄^-	18.11	20.0	104.7	14.72	10.0	99.3	19.83	4.0	94.5
草酸	0.74	5.0	104.2	0.44	2.50	98.4	0.62	1.0	96.0

份尿样（稀释50倍）磷酸盐和草酸的测定结果分别在14.72mg/L～18.11mg/L和0.44mg/L～

图4 尿样及其加标色谱图

曲线1、尿样

2、尿样加20mg/L的H₂PO₄^-和5mg/L草酸

0.74mg/L，加标回收率分别为：94.5%～104.7%和96.0～104.2%，结果见表5。其中尿样1本

底及加标样色谱图见图4.

3 小结

本工作采用国产离子色谱设备，建立了以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱，6.0mmol/LNa₂CO₃-2.0mmol/LNaHCO₃溶液为淋洗液、流量1.0mL/min等度洗脱，抑制电导检测-离子色谱法同时测定尿液中磷酸盐和草酸的分析方法。方法具有良好的重现性和准确性，操作简便快速，尿样通过C18柱的净化可以消除有机物的影响，尿液稀释50或100倍后可降低氯化物、硝酸酸盐和硫酸盐的影响。方法采用自动进样器进样，降低了人为误差和检验人员的工作强度，在离子色谱仪工作时不需要人员值守，检验人员可同时进行其他项目的检测工作，提高了工作效率，本法适用尿液中磷酸盐和草酸的同时测定。

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