维权声明:本文为Ins_982705c6原创作品,本作者与仪器信息网是该作品合法使用者,该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为,我们将追究法律责任。
细胞总RNA提取(1)细胞处理:H446、DMS114:吸弃培养基,PBS清洗2次,吸弃PBS,培养皿斜立于冰上,将剩余PBS吸干。培养皿中加入1 mL trizol,迅速吹打混匀,充分裂解细胞,移入1.5 mL无酶EP管中。H69、H526:细胞悬液放入15mL离心管中,900 rpm 离心8 min,离心后弃上清,PBS清洗2次,弃掉PBS,加入1mL trizol,迅速吹打混匀,充分裂解细胞,移入1.5 mL无酶EP管中。(2)加入200 μL氯仿(每1 mL trizol),剧烈震荡混匀30 s,室温静置10 min。(3)离心,4℃,12000 g,15 min。将水相转移至新的1.5 mL无RNA酶EP管中。(4)在水相转移液中加入异丙醇,异丙醇:转移液=1:1,上下颠倒混匀30 s(或用移液器上下抽吸混匀),室温静置10 min。(5)4℃,12000 g,离心15 min,吸弃上清液。(6)清洗RNA:在装有RNA沉淀块的EP管中加入1 mL预冷的75%乙醇(DEPC水:无水乙醇=1:3),轻微震荡,使沉淀漂浮起来,不要将RNA沉淀块弄碎。4℃ , 7500 rpm, 离心5 min,吸弃上清,再重复以上步骤2次。(7)吸弃乙醇,将EP管再离心一次(4℃ , 7500 rpm, 离心2 min),用10 μL枪头尽量吸净剩余乙醇,将EP管水平静置于超净台内,干燥RNA至RNA团块变半透明状,吸取适量DEPC水溶解RNA沉淀,轻轻吹打,充分混匀,瞬时离心收集RNA于EP管底部(RNA溶解后立即置于冰上)。若不马上做逆转录,可将RNA保存于75%乙醇中。(8)RNA浓度及纯度用NanoDrop One检测RNA的浓度及纯度。具体操作如下:a.清洗基座:开机后滴加1-2 μL去离子水于基座,浸泡10s,吸干水滴,重复三次。b.空白校正:滴加1-2 μL DEPC水于基座上,放下检测臂,进行空白校正。c.样本混匀:可用漩涡振荡器或手指轻弹方式混匀待检测的RNA样本(切记勿用枪头吹打或离心样品的方式混匀样本)。d.检测样本:滴加1 μL混匀的RNA样本于基座,放下检测臂,检测样本。连续检测样本过程无需清洗基座,只需用无尘纸朝一个方向擦干基座即可。e.清洗基座:RNA检测完成后清洗基座,步骤同第一步。(9)反转录合成cDNA具体合成步骤参照MonScriptTM RTLLL ALL-in-One Mix with dsDNase KitMonScriptTM ChemoHS qPCR MixKit试剂盒。a.反转录试剂盒中各试剂解冻,并置于冰上。b.轻弹各试剂并轻度离心。c.按照下表于EP管中添加反转录试剂。 表反转录体系
[img]" style="max-width: 100%;max-height: 100%;[/img]
d.瞬时离心,上机温育,程序设定为37℃ ,2 min(去除基因组DNA污染)→ 55 ℃ ,15 min → 85℃ ,5 min(终止反应)→ 4℃,∞,得到cDNA。反转录生成的cDNA放入- 20℃冰箱保存,若想更长时间保存可放入- 80℃冰箱。