（一）葡萄酒的酿制

1、取成熟前15天的紫皮中等颗粒的葡萄750克，挑出烂葡萄；

2、摘除蒂，用洗净的手充分捏碎葡萄；

3、装入清洁的非金属容器加盖，在20-25度环境中放置24小时；

4、加入30-40克白糖，用木筷拌匀，并把葡萄皮按入果液中；

5、发酵3-4天后再加入30-40克白糖拌匀，并把浮起的葡萄皮按入果液中；

6、7天后发酵停止，用非金属筛网布和滤纸、细布过滤去掉葡萄皮及籽；

7、静止12小时，用乳胶管虹吸出清纯酒液（或用滤纸、细布过滤）后装瓶密封；

8、30天后，再过滤一次装瓶密封、避光、低温、平躺保存。

（二）细菌总数检测
1. 配制细菌总数计数琼脂(platecountagar，PCA)培养基

胰蛋白胨 5.0g、酵母浸膏 2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂 15.0g、蒸馏水 1000mL
将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH 至7.0±0.2。分装试管或锥形瓶，121 ℃高压灭菌15min。
2. 吸取0.1mL样品匀液涂布于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。

3. 静置5min后将平板翻转，36℃±1培养48h±2h。

4. 菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits，CFU)表示。

选取菌落数在30CFU~300CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

（三）大肠杆菌数的测定

1. 配制大肠杆菌鉴别培养基EMB培养基。

2. 灭菌，将EMB培养基以及培养皿、无菌水试管、移液枪头等灭菌备用

3. 倒平板，将EMB培养基倒平板，待冷却后备用。

4. 将达到发酵终点葡萄酒取0.1mL涂布于EMB培养基中，37℃培养48h，观察结果，对大肠杆菌计数。计数方法同细菌总数测定。

（四）乙醇的检测

1、试样蒸馏

称取10g四硼酸钠溶于约200ml热水后500ml蒸馏瓶中，准确称取5.0000g样品加入容量瓶，用50ml水冲洗容量瓶，加热蒸馏，用三角瓶接收馏出液，取下，摇匀。

2、标准曲线的绘制

准确吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml0.1%（V/V）标准乙醇溶液分别置于6支10ml比色管中，加水至5ml，再依次加入1ml2%重铬酸钾溶液，5ml浓硫酸摇匀后于沸水浴加热10分钟，取出冷却，分别移入比色皿内，以零管为参比，于波长600nm处测量吸光度，根据各点吸光度绘制标准曲线或计算直线回归方程。

3、试样测定

准确吸取5ml馏出液于10ml比色管中，以下按2自“再依次加入1ml2%重铬酸钾溶液，5ml浓硫酸摇匀后于沸水浴加热10分钟，取出冷却，分别移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长600nm处测量吸光度”起依法操作。试样吸光度与标准曲线比较定量或代入标准回归方程求出试样管相当的0.1%标准乙醇溶液体积。

4、计算结果，式中：

V1—试样管与标准管相当的0.1%标准乙醇溶液体积，单位为毫升（ml）；

0.001—标准乙醇溶液浓度，单位为毫升每毫升（ml/ml）；

5—比色时所用馏出液的体积，单位为（ml）；

V—馏出液的总体积，单位为（ml）；

m—样品质量，单位为（g）；

0.7134—1ml乙醇的质量，单位为克每毫升（g/ml）。