主题：【原创】精工至善|气相色谱衍生化方法大PK

气相色谱（GC）是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离，适合分析具有挥发性且稳定性高的物质，对于一些高沸点或者稳定性差的物质分析困难。衍生化是GC分析中常用的样品处理技术，是将难于分析的物质转化为与其化学结构相似但易于分析的物质，具有提高物质的挥发性和稳定性、改善色谱的峰形、改善分离性能和灵敏度等优点。GC分析中常见的衍生化方法主要有烷基化反应、硅烷化反应、酰化反应，具体选择哪一种要根据被分析物的反应基团、实验目的等多方面综合判断。

烷基化反应

烷基化反应是衍生试剂分子中的烷基取代分析物中的活性氢（-OH、-COOH、-SH、-NH和-CONH），反应式如下：



烷基化反应常用的衍生试剂有二烷基化合物、重氮烷、五氟苯溴（PFBBr）、溴化苄、甲醇或丁醇中的三氟化硼（BF3）和四丁基氢氧化铵（TBH）等。烷基化试剂可单独用于生成酯类、醚类和酰胺类，也可与酰基化或硅基化试剂结合使用。反应条件通常比较严苛，从强酸到强碱都能生成稳定的衍生物，反应过程使用的试剂往往具有毒性。

硅烷化反应

硅烷化是气相色谱分析中最普遍的衍生化方法，是将一个硅基引入分子中，通常用三甲基硅基取代活性氢（-OH、-COOH、-NH、-NH2和-SH基团），反应式如下：



常用的硅烷化试剂有：六甲基二硅烷（HMDS），三甲基氯硅烷（TMCS)，三甲基硅咪唑（TMSI），双三甲基硅基乙酰胺（BSA）、双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）、n -甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）、三甲基硅基二乙胺（TMS-DEA）、n-n-t-丁基二甲基硅基三氟乙酰胺（MTBSTFA），其中BSTFA和MSTFA两种试剂应用最广。在硅烷化反应中，硅烷化试剂一般对水分敏感，必须注意确保样品和溶剂都是干燥的，使用的溶剂应尽量纯净和少，吡啶是最常用的溶剂，能促进反应的进行，一般情况下，硅烷化反应不再需要其他试剂，否则易产生污染。

酰化反应

酰化也是一种常见的衍生方法，是一种将酰基引入有机化合物的反应。含有活性氢的化合物（如-OH、-SH和-NH）可以通过酰基化分别转化为酯、硫酯和酰胺，反应式如下：



酰基化衍生试剂主要有酰卤、酸酐、酰基咪唑、酰胺和烷基氯甲酸酯等，常使用乙腈，吡啶，DMSO或四氢呋喃等溶剂作为反应介质。

应用

气相色谱（GC）或气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）是目前代谢组学中常用的分析工具，已广泛应用于生物样本中脂肪酸等代谢物的分析，脂肪酸分析中常用到的衍生化方法有甲酯化（烷基化）和硅烷化。

脂肪酸组成（脂肪酸谱）分析

即单个脂肪酸在总脂肪酸中所占的百分比，它强调了复杂脂质池中脂肪酸之间的代谢竞争，受到饮食和代谢的影响。总脂肪酸包含磷脂、三酰基甘油、胆固醇酯中的结合型脂肪酸和游离脂肪酸。我司建立一种以甲醇和乙酰氯为原料的甲酯化衍生、GC检测生物样本（如细胞、组织、血液）中脂肪酸组成（脂肪酸谱）的方法。

图1. 40种脂肪酸甲酯混标图

游离脂肪酸（FFA）分析

FFA在生物调控中发挥着多种关键功能，是膜脂的重要组成部分，参与膜介导的细胞功能，在各种信号通路中发挥重要作用，调节生物代谢。我司建立了BSTFA为原料硅烷化衍生、GC-MS检测生物样本（如细胞、组织、血液）中FFA方法。

图2. 34种游离脂肪酸混标图

短链脂肪酸（SCFA）分析

SCFA作为膳食纤维经肠道菌群发酵的产物，已被发现影响结肠的形态和功能，还可以调节全身免疫，发挥抗炎作用。我司建立一种以氯甲酸酯和异丁醇为原料衍生的氯甲酸异丁基化衍生（酰基化）、GC-MS分析生物样本（如粪便、血液）中 SCFA方法。

图3. 14种短链脂肪酸混标图

有没有细心的读者发现，同样是脂肪酸，同样是GC分析，我司选择的衍生化方法居然完全不同，这是为什么呢？用同一种方法难道不是最省事的吗？

下面，我们就对原因进行大揭密！测脂肪酸组成时，由于要先把结合型脂肪酸水解为FFA，酯基的水解须用酸或碱催化，乙酰氯-甲醇（甲酯化）体系反应后产生的盐酸能促进脂水解，产生的乙酸甲酯则与羧基酯交换形成终产物脂肪酸甲酯，物尽其用，非常高效。测FFA时，甲酯化衍生的方法可能使样品中的结合型脂肪酸水解为FFA，从而导致FFA定量不准，而硅烷化衍生不存在这种情况，并且具有产物易制备、稳定性好、在仪器上响应高等优点，是非常好的选择。对于SCFA来说，由于SCFA的高挥发性，常规的衍生化方法如甲酯化或硅烷化易造成SCFA组分丢失，可导致定量结果不准确，而氯甲酸异丁基化衍生过程条件温和、无需去水、衍生产物稳定性好，是最佳选择。

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参考文献

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