主题：【第十五届原创】新手上路-DAD功能帮助异常调查

背景

用Agilent1260II仪器检测某项目中控时发现原料裂峰，降低进样量后仍然裂峰，排除溶剂效应。后怀疑是色谱柱柱效不好，通过更换色谱柱后，裂峰情况依然存在。



问题排查与解决

更换Agilent1260仪器后发现不裂峰,怀疑可能是一代和二代仪器型号差别引起的分离度差异问题。



深入调查

针对此情况，怀疑是仪器问题，调查Agilent1260II裂峰的原因。其他项目在Agilent1260II上并未出现此类情况。故重新将裂峰的样品进样，发现仍旧裂峰。

查看裂峰的紫外吸收波长，发现有两个吸收波长，一个是原料的吸收波长，另一个可能是杂质的吸收波长。两者的紫外吸收图不一致，最大吸收波长有区别的。所以这两个可能是不同的物质。





后重新查看Agilent1260II上正常峰的吸收波长，发现该峰的紫外吸收波长和Agilent1260上原料的吸收波长并不重叠，再次说明该峰里面包含杂质，未分开。



结论与总结

最后说明是有杂质未分开，与色谱柱和仪器无关。和技术员沟通了解到是合成人员在更改工艺，最终并不会采用这种工艺，所以并未优化该分析方法。

这个杂质异常分析过程提示我们要学会合理利用紫外吸收原理：对于同一物质，不论浓度大小如何，最大吸收峰所对应的波长（最大吸收波长 λmax） 相同，并且曲线的形状也完全相同。这样可以帮助我们快速的判断异常峰的情况。

功能拓展-利用DAD峰纯度功能也可以确认是某峰是否包杂质

在DAD检测器上，检查某一色谱峰(A)的峰纯度，首先要对A进行恰当的积分，然后选择合适的参比(分自动和手动，一般选自动，特殊情况下选手动)，再选择波长范围(210nm-400nm较合适吧，再低会有基质的末端吸收干扰，会影响峰纯度检查的可信度，当然这要看具体的流动相及等梯度情况啦)，之后选择固定阈值(国家局要求在990及以上)，最后点一下要测的主峰就可以了。我简单的说一下峰纯度检查的原理吧，是这样的，当要检查某一色谱峰的峰纯度(A)时，软件会在A的起始点、前半中点、顶点、后半中点和结束点(共5点)分别取紫外全扫描图来进行拟合度检查，当拟合度大于阈值(即上述的990)时，软件默认为A的五个点都是一种物质，即A是一种物质的紫外吸收峰，纯的，相反，当拟合度低于阈值时，软件默认A的五个点不是一种物质，即A是两种或两种以上的物质的紫外吸收峰，不纯，就要再进行条件的优化分开它们了。所以峰纯度检查是选择有关物质检查色谱条件的重要环节之一，也就是方法的专属性啦。安捷伦一般是选择光谱归一化法计算峰纯度，简单的说就是从色谱峰上选择5个点(峰起始点、峰上升一半处的点，峰顶点、峰下降一半处的点及峰的结束点，

当然作为DAD也可以选择更多，提取这5个点的光谱图进行叠放，看其重合程度来判断色谱峰纯度。取这5个点的纯度因子平均值和阈值比较(一般采用固定阈值990即可)，大于990即为纯峰，反之则为不纯。

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