1 引言
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质。它有很好的保健效果及药用价值，具有抗菌、抗氧化、调节血糖、预防龋齿、促进酒精代谢、缓解感冒症状、润肠通便、调节血压等诸多功效^[1]。现在市场上蜂蜜种类繁多，品质优劣不等，而酸度是衡量蜂蜜及其制品是否变质的重要指标之一^[2]。

目前对蜂蜜中酸度的测定主要有两种方法，分别为电位滴定法^[3]和酸碱指示剂滴定法^[4]。电位滴定法是用酸度计测定终点，有较高的准确度和精密度，避免溶液颜色干扰，但低浓度溶液测量准确性不好。酸碱指示剂滴定法属人工感官滴定，一般用酚酞作为指示剂，要用人眼对颜色变化进行判断滴定终点，存在难以统一变色评价条件、个人对终点变色的文字描述理解不同、无法量值溯源终点颜色等问题，会给结果判定带来诸多问题，所以也对检测人员的技术和经验有着较高要求，容易产生误差。

可见光光谱滴定技术（VisibleSpectral Titration Technology, VSTT）是新发明技术，有效实现了滴定过程中的颜色数值化、图形化技术，通过化学反应过程中发生的光谱变化进行物质结构表征，同时对滴定参数同步记录，实现滴定终点的量值溯源，避免颜色变化不明显、不同人员检测等因素所产生的颜色判断误差，给出更低的检出限^[6]。VSTT在蜂蜜中酸度的测定应用尚未见报道，本文对蜂蜜中酸度含量进行了研究。

2 实验部分
2.1 测试样品
俄罗斯进口椴树蜜及向日葵蜜。
2.2 仪器与试剂

SX-Z-3.3 光谱滴定仪（秦皇岛水熊科技有限公司）；XP205 电子天平（瑞士梅特勒公司）；水浴锅（北京盈盛恒泰科技有限责任公司）；德国宾德恒温干燥箱M53；25mL碱式滴定管等。

氢氧化钠（优级纯，天津科密欧化学试剂有限公司），邻苯二甲酸氢钾基准试剂（99.95%-100.05%，天津市光复科技发展有限公司），酚酞（99.3%，伟业计量）。

2.3 试验方法
2.3.1样品的制备

未结晶的样品搅拌均匀。有结晶析出的样品，将样品瓶盖塞紧后，置于不超过60℃的水浴中温热，待样品全部溶化后，搅匀，迅速冷却至室温以备检验用。

2.3.2溶液的制备

0.01 mol/L氢氧化钠标准溶液，按照 GB/T 601配制0.1 mol/L并标定，临用时，用无二氧化碳的水稀释至0.01 mol/L。0.01 mol/L^[5]。

酚酞指示剂（1%乙醇溶液）：称取1 g酚酞用95%乙醇定容至100 ml，混合均匀^[4]。

2.3.3酸度的光谱滴定原理

滴定过程中的不同离子成分的改变引起被测物结构的改变，同步使吸收光谱发生变化（颜色变化），该变化点为国标的滴定终点。VSTT^[6]用色变曲线参数同步描述颜色变化轨迹，用数字化、图形化的曲线标识颜色变化过程，曲线上的突变峰与吸收光谱有对应关系。

2.3.4光谱滴定仪条件

光谱范围380 nm～780 nm，△λ5 nm，测量周期100 ms，积分时间100 ms，光程10.0 mm，滴定速率0.167 ml/min，搅拌速度300 转/min，靴型反应器180 mL。

2.3.5光谱滴定方法^[4]

在反应器中依次加入75 ml经煮沸后冷却的水、试样10g（精确至0.001g），溶解后加入2滴~3滴酚酞指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定至终点。按式（1）计算式样的酸度：

式中：X—试样的酸度，单位为毫升每千克（ml/kg）（消耗1mol/L氢氧化钠）V—依据图谱确认的滴定终点时所耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（ml）；c—氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；m—试样的质量，单位为克（g）。

2.3.6 感官滴定方法^[4]

在烧杯中加入试样10 g，以75 ml经煮沸后冷却的水溶解后，加入2滴~3滴酚酞指示剂，用氢化钠标准溶液滴定至溶液呈粉红色，在10秒内不褪色为终点。代入公式（1）计算。

2.4 统计学处理
运用SPSS 22.0软件对两种方法的测定结果进行配对样本t检验分析，推论出差异发生的概率P值（即sig值），比较两种方法有无差异，验证所得结论的统计学意义。

3 结果3.1 蜂蜜酸度的光谱滴定终点确认

酸度的光谱滴定过程中，CIE1976(L^*a^*b^*)均匀彩色空间参数值的明度指数L^*值、红-绿色品指数a^*值、黄-蓝色品指数b^*值，均发生了相应改变，滴定终点时各数值变化明显减小，变化轨迹如下图所示：

图1-图3表明，L^*值在x轴上方，在滴定体积约1.7ml后开始下降，说明溶液明度在降低；L^*值曲线整体看不平滑，有个别干扰峰，可能是在滴定过程中溶液波动从而影响了透光度。a^*值在滴定体积约1.6ml后明显增大，一直处于x轴上方，说明溶液颜色由无色向红色转变，并越来越深。b^*值在滴定体积约1.6ml后开始下降，在约2.3ml由x轴上方下降至x轴下方，说明溶液颜色由很淡的黄色渐变为很淡的蓝色。试验溶液变化为混合色，即溶液由带着很淡的黄色至几近于无色转变红色。光谱滴定颜色的测定数据与传统感官滴定人工判断颜色的变化相符。

本文采用VSTT的参数G峰值做为滴定终点^[6] ，更接近a^*值和b^*值的共同变色终点。以加入的滴定剂的体积（V）作为横坐标，以VSTT终点参数G作为纵坐标，绘制G-V滴定曲

线，曲线上的最大峰值即为滴定终点，如图4所示。

3.2光谱滴定法测定酸度的检出限

本次重复测定10次空白试验^[7]，结果按公式（1）计算为样品中的酸度含量，结果见表1，并按公式（2）计算方法检出限。

MDL = t _(n-1_，_0.99) × S…… （2）

式中：MDL—方法检出限；n—样品的平行测定次数；t—自由度为n -1，置信度为99%时的t分布值（单侧）；S—n次平行测定的标准偏差^[7]。

本次测定t ₍₁₀_，_0.99)值为2.821，以此计算本方法的检出限为0.10 ml/kg，最大差异值为0.12，在允许的差异范围0.18±0.05之内，符合HJ 168—2020标准中“检出限可允许的差异范围应在‘空白试验测定值的均值估计检出限的1/2’以内”的要求^[7]。此检出限的测定，弥补了感官滴定法没有检出限的缺陷。

表1 光谱滴定法测定酸度含量的检出限（n=10）

Table 1 The detection limit of acidity in honey determined by spectrometric titration (n=10)

10次空白测定结果（ml/kg）

results of 11 blank test (ml/kg)

平均值(ml/kg)

average value

(ml/kg)

标准偏差（ml/kg）

standard deviation (ml/kg)

0.22，0.18，0.20，0.18，0.10，0.16，0.20，0.17，0.20，0.13，

0.18

0.036

3.3样品的测定结果比对

在相同的前处理条件下，利用感官滴定法和光谱滴定法测定样品的酸度，同时进行样品加标回收率试验，验证两种方法的可靠性，具体数据见表2、表3。

表2 样品中酸度的测定结果及t检验

Table 2 Determination results and t-test of acidityin honey

样品名称

sample name

滴定方法

titration method

测定结果（mL/kg）

determination results

平均值

( mL /kg)

average value

( mL /kg)

RSD（%）

双尾概率

P(sig.)

double tail probability P(sig.)

椴树蜜

感官滴定法

光谱滴定法

17.32,16.85,16.93,17.15,17.13,17.24

17.58,17.50,16.88,17.70,17.15,17.23

17.11

17.34

1.048

1.784

0.114

向日葵蜜

感官滴定法

光谱滴定法

29.18,30.55,28.48,29.04,29.84,30.33

28.83,30.03,31.39,30.30,31.36,30.90

29.57

30.47

2.714

3.189

0.147

表3 回收率的测定结果

Table 3 Determination results ofrecovery rate

样品名称

sample name

样品质量（g）

sample quality (G)

冰醋酸加标量（ml）

CH₃COOH standard addition amount(ml)

滴定方法

titration method

测定值（ml/kg）

determination value(ml/kg)

回收率（%）

rate of recovery(%)

椴树蜜

10.0251，10.0363，10.0520 10.0356，10.0571，10.0209

0.01

感官滴定法

光谱滴定法

32.70,32.17,32.32

32.78,33.54,33.13

96.3, 94.8,95.3

94.3, 96.6,95.2

向日葵蜜

10.0373，10.0286，10.0573 10.0137，10.0441，10.0318

0.01

感官滴定法

光谱滴定法

44.70,45.53,44.91

46.04,46.97,46.48

96.1,98.1, 97.0

96.1, 97.9, 96.7

由表2、表3可知，两种方法测定样品中酸度结果的精密度均符合SN/T 0852-2012要求（平行试验结果的允许误差为0.1）^[4]；两种方法测定样品中酸度结果均无显著差异(P>0.05)；感官滴定法的加标回收率为 94.8%～98.1%，光谱滴定法的加标回收率为94.3%～97.9%，符合GB/T 27404-2008中技术要求（被测组分含量1~100 mg/kg时，回收率范围90%～110%）^[8]，表明两种方法均准确、可靠。

4 结论

可见光光谱滴定技术（VSTT）是由我国学者首次提出的滴定分析理论，测量可见光全谱同步吸收变化，用光谱滴定曲线的凸变峰标示滴定终点的突跃，实现了有色滴定分析的自动化、数字化，是滴定分析领域的新突破。目前，光谱滴定法的应用研究还处于空白状态，本文首次利用光谱滴定法测定蜂蜜中酸度，通过精密度、准确性、检出限等指标验证了方法的可行性，证明了光谱滴定可代替感官滴定的可操作性，为VSTT的应用研究提供了有价值的参考，进一步发展VSTT或将成为解决化学研究、检验检测等行业问题的新的技术手段。

参考文献
[1] 郝彬秀,应剑,刘婷,王春玲.蜂蜜活性和功效的研究进展[J].食品研究与开发.2015,36(1)：148~152.
[2] 李谦,彭佼,杨杰,白雪.电位滴定法测定蜂蜜及其制品的酸度[J].贵州医药.2008, 32(11)：1047~1048.
[3] 北京百花蜂业科技发展股份公司,中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.蜂蜜及其制品酸度的测定电位滴定法 GH/T 1141-2017.北京：中国标准出版社，2018：1~4.
[4] 中华人民共和国浙江出入境检验检疫局, 中华人民共和国上海浦江出入境检验检疫局. 进出口蜂蜜检验规程 SN/T 0852-2012.北京：中国标准出版社，2013：11.
[5] 化学试剂标准滴定溶液的制备 GB/T 601-2016.北京：中国标准出版社，2016：2~3.
[6] 王飞.化学光谱滴定技术.[M].北京：中国标准出版社，2019：18,25~27,55~71.
[7] 生态环境部.环境监测分析方法标准制订技术导则HJ 168—2020.北京：中国标准出版社，2021：18.