药物靶蛋白鉴定方法

非蛋白质组学鉴定方法

非蛋白质组学的传统药物靶蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的迁徙分析等方法，通常耗时、耗力且不适合进行高流通量的筛选。目前，所使用的技术包括：第一，蛋白鉴定的图象分析，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量，未被修饰的小蛋白错误率大约 30%，而翻译后修饰蛋白错误率更高，故需联合其他技术完成鉴定；第二，微量测序，首先使经凝胶分离的蛋白直接印迹在 PVDF 膜，经过一系列操作后将其置于测序仪中进行蛋白质鉴定，但该方法仍然存在一些缺点，如由于酸性水解或者部分降解而产生氨基酸的变异，故应联合其他的蛋白质属性进行鉴定。

化学蛋白质组学方法

化学蛋白质组学方法一般先将小分子化合物通过与蛋白质溶液反应，使化学探针或小分子化合物与固相联接，得到被修饰的固相微球，然后利用合适的分离技术将这些蛋白质纯化，结合 LC-MS 分析，得到靶蛋白的信息。

亲和色谱法

亲和色谱法是化学蛋白质组学策略中较为经典的方法之一，它主要应用于研究蛋白质与生物活性小分子或蛋白质与蛋白质的相互作用^[17]。该方法通过官能团将配体结合在固相基质中，然后与蛋白质孵育，此时与配体结合的蛋白会留在基质上，最后通过变性或与自由配体竞争将结合蛋白洗脱下来，再通过凝胶电泳或者 LC-MS 进行分析。该方法的缺陷在于所研究分子衍生物活性不确定、材料配体结合力差异性以及非特异性吸附都将会干扰研究结果。

基于活性的化学蛋白质组学技术

基于活性的化学蛋白质组学技术（ABPP）是广泛使用的技术之一。ABPP 是由美国的 Cravatt 课题组在 2002 年首次提出，最早用于酶谱分析，之后被应用于药物靶蛋白筛选。ABPP 技术的关键是合成同时带有反应基团和标记物的 ABPP 探针，可进一步与待测的蛋白质发生相互反应。药物靶点筛选领域设计的 ABPP 探针通常包括三

个功能部分：反应基团、连接基团和报告基团。与二维凝胶电泳法（2-DE）、同位素编码亲和标签（ICAT）等技术相比，ABPP 技术着重研究蛋白质的表达和功能，可从天然蛋白质组样品中直接筛选出与小分子特异性结合的蛋白质，从而能更直接快速地明确小分子和蛋白质之间的相互作用，确定小分子的作用靶点，这对于筛选具有低亲和力的靶蛋白极为有利。另外，根据富集和鉴定策略的不同，ABPP 技术可分为竞争性标记方法和生物正交的探针模拟物标记方法。

1.%2.%3 非化学修饰的蛋白质组学方法

1.1.%3.%4 细胞热位移测定

在过去 20 年中，热位移分析（TSA）已成为最广泛使用的无修饰药物靶点发现方法之一。这种方法简单直接，但探针无法区分不同的蛋白质，因此 TSA 仅适用于纯化蛋白质的实验。为了规避这个问题，Molina 等人开发了一种概念上相似的技术，称为细胞热位移测定（CETSA），用于直接研究细胞环境中的药物-靶标相互作用。如图

（A）所示，细胞裂解物或完整细胞的多个等分试样首先用药物或载体处理，加热到不同的温度并冷却，然后通过离心分离出可溶性部分。随着温度的升高，蛋白质逐渐展开以暴露疏水核，导致蛋白质在高温下沉淀。蛋白质越稳定，蛋白质对热诱导沉淀的抵抗力越高，因此，可以测定可溶性蛋白质随温度变化的稳定性曲线。例如，该方法通过叶酸抗癌药物甲氨蝶呤与二氢叶酸还原酶的结合、雷替曲塞与胸苷酸合成酶的结合进行了药物靶标的验证。

CETSA 是一种允许研究活细胞中药物靶点的方法。CETSA 结合小分子库可用于筛选潜在抑制剂、评估靶标参与效率和监测靶标特异性。此外，CETSA 还可用于筛选新药和表型化合物的靶点，解决脱靶蛋白、结合机制、药物疗效和完整细胞耐药性等问题。

1.2.%3.%4 热蛋白组学分析

热蛋白组学分析（TPP）首先将蛋白在有或无活性小分子情况下孵育，并加热到不同的温度以诱导蛋白变性，剩余的可溶性蛋白用缓冲液提取。如图所示，在每个温度下，可溶性蛋白通过高分辨质谱进行量化，画出变性曲线，进一步测

定热稳定性和识别配体引起的变化。其中，50% 蛋白发生聚沉时的温度为 Tm（melting temperature），通过对比加药前后 Tm 的变化，确定活性分子的靶蛋白。TPP 可以通过定量 MS 分析，在蛋白质组水平评估活细胞中活性分子与蛋白结合的情况。

图（A）细胞热位移测定和（B）热蛋白组学分析简要工作流程[14]

药物亲和反应的靶点稳定性技术

药物亲和反应的靶点稳定性技术（DARTS）是一种鉴定药物靶标的新方法。药物与靶蛋白结合后，靶蛋白对蛋白酶的敏感性降低，与对照组相比，药物结合蛋白更不易水解。这种差异可通过蛋白凝胶电泳和质谱等技术对差异蛋白进行鉴定，可以确定药物直接作用的靶点蛋白，最大优势是不需要对药物进行任何化学修饰，即可以确定药物的直接结合蛋白。DARTS 在天然小分子靶点的鉴定中发挥了重要的作用，例如对 ecumicin 、白藜芦醇（ resveratrol ）等多种天然产物蛋白靶点的鉴定^。但

DARTS 也存在局限性，例如细胞裂解液中的低丰度蛋白的鉴定和非特异性结合会导致蛋白对蛋白酶的敏感性升高增加。利用这一特性，研究者还开发了药物亲和力响应靶稳定性的方法用于药物靶点筛选。

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