300、500、1000、1500、2000、3000μM的 CA浓度梯度，在 5%CO₂、37 ℃的培养箱中无血清孵育 6 h，最终得出了 CA处理后 U-87MG的细胞活力-浓度依赖型曲线，如图所示。根据公式，400μM-500μM的 CA对细胞的抑制率可达到 50%；细胞刺激浓度为 2mM时细胞的存活率只有 20%；当 CA浓度为 2.5mM-3mM时细胞已经死亡。

图不同浓度梯度（0、50、100、300、500、1000、1500、2000、3000 μM）CA 刺激 U-

87MG 细胞测的细胞活力曲线图

蛋白免疫印迹分析

CA 主要通过迈克尔加成的方式与蛋白中亲核氨基酸结合而起到抗肿瘤、抗炎作用。CA 与半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸等亲核残基发生反应后，会在目标蛋白上留下一个游离醛基。CA 的醛基（-CHO）由于具有很大的活性，能与酰肼生物素中的肼基

（NH₂-NH₂）反应生成腙类衍生物，随后可被氰基硼氢化钠还原，可进一步被携带

HRP 基团的抗生物素 Avidin 可视化。如图所示，Westerning blotting 实验结果表明，随着 CA 浓度增加，曝光后的条带逐渐加深，这证明了 CA 以迈克尔加成形式共价结合到蛋白上，从而在蛋白上引入可以被酰肼生物素标记的醛基；同时，也表明酰肼

化学法能够用于 CA 靶蛋白的标记。

图一定浓度梯度（0、20、50、100、300、500 μM）CA 刺激 U-87MG 细胞的免疫印迹结

果和考马斯染色结果

CA修饰肽段分析

为了验证本方法的可行性，按照图所示的实验流程，选用 50、100、300μM CA处理的 U-87MG细胞，每个样品各做三次生物学重复并进行分析。如图 2-3所示，将在两次及以上生物学重复实验中鉴定到的位点规定为高可信度位点，在浓度50 μM 的 CA刺激下，可从 U-87MG细胞中鉴定到 74个高可信度的 CA修饰位点；在 100μM 的 CA刺激下，可从 U-87MG细胞中鉴定到 130个为高可信度的 CA修饰位点；在 300

μM 的 CA 刺激下，可从 U-87MG 细胞中鉴定到 243 个高可信度的 CA 修饰位点。

图 CA 刺激U-87MG 细胞，浓度为50 μM（A）、100 μM（B）和300 μM

tware (D)

通过对不同浓度高可信度位点数据集的交叉拼接，最终确定了 U-87MG细胞中

276 个高可信度 CA 修饰位点，对应于 219 个 CA 靶蛋白

鉴定到的蛋白中包含很多具有重要生物学意义的高可信靶蛋白，例如，VDAC 家族是在三个浓度中均可被反复鉴定到的蛋白；VDAC 家族蛋白主要分布在线粒体上，具有非常重要的生理作用。如图 2-5 所示，VDAC2 蛋白可通过肽段 PMCIPPSYADLGK 的二级谱图证明其鉴定的可靠性。据报道，BAX和 BAK是细胞凋亡的两种重要介质，而 VDAC2 对 BAX 的功能发挥具有重要的作用。此外，鉴定到的蛋白中还包括参与氧化还原稳态的重要蛋白，如PRDX1、PRDX6、TXNRD1、TXNRD2 和 GPX4。这表明 CA 可以通过靶向重要的氧化还原调节酶来破坏细胞的抗氧化性。

另外，统计了所有高可信位点中三个氨基酸残基（CHK）的比例，如图所示，分

别鉴定到了 264 个半胱氨酸位点、7 个组氨酸位点以及 5 个赖氨酸位点，显而易见， CA 主要靶向蛋白中的半胱氨酸残基，这与已报道的C、H、K 三个残基的亲核活性大小顺序一致。

半胱氨酸是一种含硫氨基酸，硫元素的多氧化态赋予了半胱氨酸化学上的“可变性”与生物学功能上的“可调节性”。半胱氨酸具有独特的亲核性和氧化还原敏感性，是很多酶的活性部位。进一步对鉴定到的半胱氨酸位点进行分析，根据人类蛋白质组

fasta文件，提取出鉴定到的半胱氨酸位点的前后 20位的氨基酸序列。进而，使用Weblogo对 C（0位）周围氨基酸出现的频率进行分析，如图所示，在-1、1位 A、L氨基酸出现，但是并未看出明显的序列特征。

图以半胱氨酸 C 为中心前后 20 位氨基酸的频率分图

随后，将以 C 为中心的前后 20 位氨基酸的氨基酸序列提交到 Plogo，并以人类蛋白质组所有 C 为中心的氨基酸序列为背景进行 motif 分析。如图所示，在以 C 为中心的-1 位上倾向于 A、N 类氨基酸，更容易发生迈克尔加成反应，当 C 周围是 K 或 R 等碱性氨基酸时，CA 与蛋白中亲核氨基酸的反应更弱。根据先前文献报道，当 C 周围出现 K\R 等碱性氨基酸时，C 可能更容易发生氧化，导致 Cys-SH 的活性低而不利于取代或加成等反应的发生。当 X+2 或 X?2 位没有第二个半胱氨酸时，CA 更倾向于修饰半胱氨酸，这是硫氧还蛋白家族的代表基序。这与硫氧还蛋白家族成员被确定为CA 靶点的数据一致。

图以半胱氨酸 C 为中心前后 20 位氨基酸序列的 motif 富集分析

由于蛋白质的结构不同，当 CA进入活细胞内，靶向的蛋白也是不一样的。同样，当 C、H、K 在蛋白中的位置不同，CA 与其反应活性也是不同的。如图 2-9 所示，不同蛋白与 CA 反应的位点 C、H、K 种类、数目有很大的差异，178 个鉴定的靶蛋白中只有 1 个位点与 CA 反应，32 个靶蛋白中有 2 个位点、4 个靶蛋白中有 3 个位点、3 个靶蛋白中有 4 个位点以及 2 个靶蛋白中有 5 个位点被 CA 占据，主要以 1-2 个位点反应为主。所鉴定到的靶蛋白中，GAPDH、MGST1、RPS28、VIM 等蛋白中的半胱氨酸全部被 CA 占据。其中，GAPDH 在糖酵解中起着非常关键的作用，说明 CA 会影响糖酵解的进程。此外，MGST1 是胰腺癌细胞中铁死亡的氧化还原敏感抑制剂。